【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于外来入侵蚂蚁检测的，具体涉及一种引物组、其应用及用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法。
技术介绍
1、外来入侵物种（invasive alien species, ias）是造成生物多样性丧失的主要原因，对生态系统的危害持续存在。外来入侵蚂蚁（invasive alien ant, iaa）是世界上最具侵略性、最具竞争力和分布最广的外来物种之一。小火蚁 wasmannia auropunctata(roger,1863)，也被称为“电蚁”，已被无意中传播至世界各地。在其定殖区域内，小火蚁可减少本地蚂蚁和其他无脊椎动物的生物多样性，影响脊椎动物（如陆龟和鸟类）的繁殖力，并对人类造成不可忽视的健康危害。小火蚁的毒刺可引起过敏人群的过敏性休克反应，并伤害家畜（如猫和狗）。这种杂食性外来物种之所以能够在世界范围内迅速扩张，很大程度上是因为它能够在多样化的栖息地中定居，并能忍受各种气候和环境条件。
2、目前，针对小火蚁的检疫鉴定，主要采用形态学鉴定以及条形码鉴定技术。传统的形态学鉴定技术，严重依赖检测人员的技术背景和工作经验，且常准确度不高，耗时耗力。而条形码技术依赖基因组特征，对特定基因片段（如coi基因等）进行扩增、测序以及序列分析，得出的结论相对形态学技术更为可靠，但检测过程复杂、依赖复杂的仪器（如pcr仪和测序仪等），检测周期长，工作效率低。故提供一种特异性强、灵敏度更高的鉴定方法是技术工作者亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种引物组、其应用及用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法。通过实施该检测方法用于鉴定小火蚁样本具备特异性强、灵敏度高、准确性高、操作简便、检测时长短的优点。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种引物组，由上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5组成。
4、上游引物1-wa1-f7的核苷酸序列为：
5、aagctaatacgactcactatagggtcatctagtgagaaattccttcatcctc。
6、下游引物1-wa1-r2的核苷酸序列为：
7、ctggttaatgcgaaagctttgttgtttt。
8、rna引物1-wa1-rna5的核苷酸序列为：
9、fam-gagagagagagcacgcuuuauauuaaau-bhq1。
10、本专利技术还提供了上述引物组的应用，应用具体为如下（1）或（2）：
11、（1）检测样本中是否含有小火蚁；
12、（2）用于制备检测样本中是否含有小火蚁的试剂盒。
13、本专利技术还提供了一种用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法，该方法包括如下步骤：
14、s01、供试虫样的选择：
15、选取实验虫样包括小火蚁6头和其他近似虫样6头，共12头。
16、s02、引物及探针的设计合成：
17、根据genbank公布的小火蚁序列，选取得到特异性靶标序列waur-275；
18、经合成，得到初轮上游引物序列seq id no.1~ seq id no.8；
19、初轮下游引物序列seq id no.9~ seq id no.16；
20、rna引物序列seq id no.17~ seq id no.24；
21、s03、检测样本dna提取
22、取0.1-0.5 mg的虫样置于1.5 ml无菌离心管中，用一次性组织研磨杵捣碎，按照us everbright基因组dna小量制备试剂盒操作说明逐步提取，提取后的dna经超微量分光光度计检测浓度后，保存于-20℃冰箱备用。
23、s04、rna引物筛选
24、使用基础荧光恒温扩增检测试剂盒进行实验，反应体系20 μl：dna上游引物0.5 μl，dna下游引物0.5 μl，rna引物0.2 μl，1.8 μl无酶蒸馏水，扩增模板5 μl，基础荧光恒温扩增检测试剂盒中的激活液12 μl，基础荧光恒温扩增检测试剂盒中的干粉一管；
25、在含有基础干粉的八连管中加入浓度为20 μmol/l的上游引物、下游引物各0.5 μl，250 ng/μl的rna引物0.2 μl，1.8 μl无酶蒸馏水，共3 μl，瞬时离心；
26、离心后沿八连管壁中下部加入5 μl dna，瞬时离心，室温静置2 min；沿八连管管壁中下部加12 μl激活液，盖上盖子，震荡混匀10 s，瞬时离心后上机检测；
27、荧光定量pcr仪温度设置为42℃，1 min进行一个循环，每个循环进行一次信号采集，报告基团设置为fam；配制完成后在实时荧光pcr仪进行实时检测；
28、将对应的引物组进行对比，选择ct值最小且终点荧光值最高的组合确定rna引物，再根据rna引物对应的4组dna引物结果，根据ct值的大小及终点荧光值的高低进行选择，选取ct值相对较小和终点荧光值相对较高的组别，若无法比较则率先选择ct值最小的，最终确定rna引物定为1-wa1-rna5；
29、实验分为实验组和空白对照组；
30、其中，实验组为以2号小火蚁的dna作为扩增模板，浓度为5.2 ng/μl，空白对照组为以水作为扩增模板。
31、s05、dna下游引物筛选
32、rna引物定为1-wa1-rna5，dna上游引物定为1-wa1-f4，dna下游引物分别可选自1-wa1-r1、1-wa1-r2、1-wa1-r3、1-wa1-r5、1-wa1-r6、1-wa1-r7和1-wa1-r8中的一种；
33、参照s04步骤中的反应体系与条件，通过反应筛选得到ct值较低的dna下游引物为1-wa1-r2；
34、s06、dna上游引物筛选
35、rna引物定为1-wa1-rna5，dna下游引物定为1-wa1-r2，分别以1-wa1-f1、1-wa1-f2、1-wa1-f3、1-wa1-f4、1-wa1-f6、1-wa1-f7和1-wa1-f8作为dna上游引物进行实验，参照s04步骤中的反应体系与条件，筛选得到ct值较低的dna上游引物1-wa1-f7；
36、s07、经验证筛选得出所述的上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5；
37、s08、通过混合上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5、按照s04中的反应体系以及反应程序进行试验，从而确定检测结果。
38、上机后溶剂内荧光产生步骤主要分为三步进行，分别为dna扩增、dna转录为rna、rna引物水解产生信号。dna扩增步骤：重组酶与dna引物结合，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物组，其特征在于，由上游引物1-WA1-F7、下游引物1-WA1-R2和RNA引物1-WA1-RNA5组成；
2.引物组的应用，其特征在于，为如下(1)或(2)：
3.一种用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S04中，基础干粉由DNA重组酶、虾碱性磷酸酶、T7 RNA聚合酶、逆转录酶和信号放大酶的冻干产物及冻干保护剂组成。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S04中，激活液由核苷三磷酸和缓冲液组成，缓冲液由氯化镁、Tris-HCl和氯化钾及无酶超纯水配置而成。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法，其特征在于，在步骤S03中，RNA引物筛选的步骤为：
7.根据权利要求6所述的一种用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法，其特征在于，DNA下游引物筛选的步骤为：
8.根据权利要求3所述的一种用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法，其特征在于，DNA上游引
...【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，由上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5组成；
2.引物组的应用，其特征在于，为如下(1)或(2)：
3.一种用于检测样本外来入侵蚂蚁是否为小火蚁的方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤s04中，基础干粉由dna重组酶、虾碱性磷酸酶、t7 rna聚合酶、逆转录酶和信号放大酶的冻干产物及冻干保护剂组成。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：王佳莹，崔俊霞，段维军，刘丽，颜书怡，李文，王媛婧，王路歌，
申请(专利权)人：宁波海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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