【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测，具体涉及一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、单增李斯特菌是一种革兰氏阳性短杆菌，在低ph高盐浓度等恶劣生长条件下依旧可以生长，在生物被膜的保护下高度耐受消毒剂、抗菌剂。人类感染李斯特菌的主要来源为即食食品，其次为奶制品、海鲜产品。除此之外，它还广泛存在于新鲜蔬果、肉制品、冷藏食品中。感染单增李斯特菌后，其潜伏期较长很难追踪源头且在老人、孕妇等免疫力低下人群中表现出很高的死亡率。金黄色葡萄球菌是一种容易引起食物中毒的革兰氏阳性菌，它对营养要求不高、对不良环境的抵抗能力良好，常存在于奶、蛋、火腿肠等高蛋白食品中。金黄色葡萄球菌能引发多种机体严重感染，轻者表现为化脓性皮肤感染，严重时能危及生命。另外，金黄色葡萄球菌分泌的各种毒素或毒力因子，如金黄色葡萄球菌肠毒素已被证明能够引发如恶心、腹泻、呕吐等中毒现象，严重时还会出现肠胃痉挛、水平衡失调甚至是脱水。该毒素结构稳定，即使是热处理过程中也能保持甚至稳定增加。金黄色葡萄球菌亚群对抗生素没有反应，无法实现清除细菌。综上，建立一种快速检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测方法显得尤为重要。
2、现阶段，针对致病菌的检测技术还是以传统微生物培养、鉴定法和psr为主。然而，前者虽为检测金标准，但培养时间长、操作繁琐不适用于现场快速检测；后者特异性强、灵敏度高，但仍然需要昂贵的大型仪器设备，难以进行现场检测。聚合酶螺旋扩增反应(polymerase spi ra l react ion)利用两对引物、单酶系统
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供了一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr引物组、试剂盒及检测方法，对其进行特异、快速、渐变的现场检测，改善原有技术操作繁琐、费时的弊端。
2、为了实现本专利技术的目的，本专利技术将采用如下所述的技术方案予以实现。
3、一种检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr引物组，包括检测单增李斯特菌的特异性hlya-psr引物组和检测金黄色葡萄球菌的特异性nuc-psr引物组，其中，
4、所述特异性hlya-psr引物组包括hlya-ft引物、hlya的hlya-bt引物、hlya-if引物和hlya-ib引物，其中：所述hlya-ft引物的核苷酸序列如seq id no.1所示、所述hlya-bt引物的核苷酸序列如seq id no.2所示、所述hlya-if引物的核苷酸序列如seq id no.3所示和所述hlya-ib引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；
5、所述特异性nuc-psr引物组包括nuc-ft引物、nuc-bt引物、nuc-if引物和nuc-i b引物，其中，所述nuc-ft引物的核苷酸序列如seq id no.5所示、所述nuc-bt引物的核苷酸序列如seq id no.6所示、所述nuc-if引物的核苷酸序列如seq id no.7所示和所述nuc-ib引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。
6、一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr试剂盒，包含所述的双重psr引物组。
7、作为本专利技术的优选方案，所述双重psr试剂盒还含有10×缓冲液、dntp、bst dna聚合酶、甜菜碱、hnb指示剂。
8、作为本专利技术的优选方案，所述10×缓冲液包含：tr i s-hcl 200mm，kcl 500mm，(nh)4so4100 mm，mgso420 mm，1％tr iton x-100。
9、作为本专利技术的优选方案，所述双重psr试剂盒还含有bst dna聚合酶。
10、一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr检测方法，包括下述所述的步骤：
11、(1)设计并合成所述的双重psr引物组；
12、(2)配制psr反应体系，所述psr反应体系的终浓度为：25μl，包括bst dna聚合酶8000un its/ml1μl，10×bst buffer 2.5μl，甜菜碱(5m)6μl，dntps(10mm)5μl，mgso4(100mm)1.5μl，dna模板1μl，hlya-ft/bt(50μm)各0.125μl，hlya-if/ib(50μm)各0.0625μl，nuc-ft/bt(50μm)各0.25μl，nuc-if/ib(50μm)各0.125μl，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl；
13、(3)扩增所述psr反应体系，将所述psr反应体系进行扩增反应，反应温度为65℃，持续15-60min；
14、(4)扩增产物检测：取扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳、或在扩增产物中加入1μlhnb溶液，观察反应管中颜色变化。
15、作为本专利技术的优选方案，在所述步骤(3)中，最佳持续时间为35min。
16、有益效果
17、一、灵敏度高,对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测限低至10-4ng/μl；
18、二、检测时间短，30-45min即可获得检测结果，比普通pcr更省时；
19、三、对仪器设备要求低，无需大型昂贵仪器，如：pcr仪、传感器等，仅通过指示剂变色判断扩增是否发生；
20、四、对比免疫学技术，成本较低、灵敏度更高；
21、五、操作简单，这个过程无需操作复杂仪器，仅需水浴或金属浴即可完成反应。
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1.一种检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PSR引物组，其特征在于，所述双重PSR引物组包括检测单增李斯特菌的特异性hlyA-PSR引物组和检测金黄色葡萄球菌的特异性nuc-PSR引物组，其中，
2.一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PSR试剂盒，其特征在于，所述双重PSR试剂盒包含权利要求1所述的双重PSR引物组。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PSR试剂盒，其特征在于，所述双重PSR试剂盒还含有10×缓冲液、dNTP、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、HNB指示剂。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PSR试剂盒，其特征在于，所述10×缓冲液包含：Tris-HCl 200mM，KCl 500mM，(NH)4SO4100 mM，MgSO420 mM，1％Triton X-100。
5.根据权利要求2、3或4所述的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PSR试剂盒，其特征在于，所述双重PSR试剂盒还含有Bst DNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PSR检测方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，最佳持续时间为35min。
...【技术特征摘要】
1.一种检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr引物组，其特征在于，所述双重psr引物组包括检测单增李斯特菌的特异性hlya-psr引物组和检测金黄色葡萄球菌的特异性nuc-psr引物组，其中，
2.一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr试剂盒，其特征在于，所述双重psr试剂盒包含权利要求1所述的双重psr引物组。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重psr试剂盒，其特征在于，所述双重psr试剂盒还含有10×缓冲液、dntp、bst dna聚合酶、甜菜碱、hnb指示剂。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆颖健，张莫然，孙静，李向菲，庞心怡，陈洪周，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：
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