一种基于RPA-CRISPR/Cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，针对PCV3ORF2保守序列设计出的经过二次筛选的RPA特异性引物和靶向保守序列的crRNA，配制RPA扩增体系与CRISPR/Ca s12a预混液，将RPA扩增体系与CRISPR/Cas12a预混液于单管中混合，在crRNA介导下进行特异性切割反应，反应完成后加入单层氧化石墨烯‑ssDNA‑FAM底物，通过蓝光照射观察结果。本发明专利技术的检测方法具有快速灵敏、不依赖大型仪器、结果直观可视化、避免气溶胶污染等特点，可实现对猪圆环病毒3型的现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测，特别涉及一种基于rpa-crispr/cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法。

技术介绍

1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)是已知动物病毒中能够自主复制的最小病毒之一，其基因组是一条共价结合形成的闭环状的dna单链，以滚环方式复制，呈20面体对称，无囊膜，直径大约17nm～20nm。根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列可将其分pcv1-pcv4。pcv1的感染在猪群中很常见并且猪可以产生针对该病毒的抗体。pcv2是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus disease,pcvd)的主要病原体，临床上表现为断奶后多系统消耗综合症(pmws)，呼吸道和肠道疾病，以及猪皮炎肾病综合征(pdns)和生殖衰竭。2016年美国的某猪场在对患有猪皮炎与肾病综合征的发病猪和患有繁殖障碍的母猪与其流产的胎儿进行样品检测时首次发现了猪圆环病毒3型。pcv4于2019年在我国湖南省患有猪呼吸道疾病、腹泻及皮炎肾病综合征的猪群中首次发现。

2、被pcv3感染的猪主要表现为猪皮炎与本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，针对PCV3 ORF2保守序列设计出的经过二次筛选的RPA特异性引物和靶向保守序列的crRNA，配制RPA扩增体系与CRISPR/Cas12a预混液，将RPA扩增体系与CRISPR/Cas12a预混液于单管中混合，在crR NA介导下进行特异性切割反应，反应完成后加入单层氧化石墨烯-ssDNA-FA M底物，通过蓝光照射观察结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，所述PCV3 ORF2保...

【技术特征摘要】

1.一种基于rpa-crispr/cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，针对pcv3 orf2保守序列设计出的经过二次筛选的rpa特异性引物和靶向保守序列的crrna，配制rpa扩增体系与crispr/cas12a预混液，将rpa扩增体系与crispr/cas12a预混液于单管中混合，在crr na介导下进行特异性切割反应，反应完成后加入单层氧化石墨烯-ssdna-fa m底物，通过蓝光照射观察结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr/cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，所述pcv3 orf2保守序列通过多序列比对筛选得到，并与pcv1、pcv2和pcv4序列比对，以保证检测的特异性。

3.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr/cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，所述crrna由repeat序列和sp acer序列组成，选取pcv3orf2保守序列中位于pam位点5’-tttn-3’附近的20bp靶标序列，作为特异性spacer序列，加上一段重复的repeat序列，设计出两条切割靶点位于保守序列中的预测打分最高、效率最高的crrna。

4.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr/cas12a单管快速可视化检测猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，crrna为crrna-1或crrna-2；其中，crrna-1靶向tttc位点，序列如seq id no.2所示；crrna-2靶向ttt g位点，序列如seq id no.3所示。

5.根据权利要求1所述的一种基于rpa-...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫小兵，王歆语，毕明芳，张鑫鑫，朱刚，吴薛琴，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：