【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种用于提高虫草素产量的重组蛹虫草及应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、蛹虫草(cordyceps militaris)，又称北冬虫夏草、北虫草，是一种常用的食药用真菌，与冬虫夏草属于同属真菌。与冬虫夏草苛刻的种植条件不同的是，蛹虫草不需要通过寄生就可以在实验室等环境下培养得到子实体，并且蛹虫草的化学能力和药用特性与冬虫夏草相近，被视为冬虫夏草的完美替代品。蛹虫草含多种药用成分，如虫草素、虫草多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶(sod)等，拥有抗疲劳、提高免疫力、抗菌消炎、抗癌等多种功效。虫草素作为蛹虫草最重要的活性成分之一，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。研究表明虫草素含有多种生物功效，具有肺肾的保护性、抗三高、抗肿瘤、神经保护性、抗炎、抗氧化和免疫调节等生物活性，在抗衰老、保健、新药研制等领域备受学者关注。因此，虫草素在开发为药品或保健食品方面将有广阔的应用前景。
2、目前，虫草素的来源途径主要有三种：化学全合成法、从天然或人工培育的虫草属真菌子实体中提取或从虫草属真菌液体发酵培养的发酵液中提取。然而，通过化学全合成生产虫草素，合成过程复杂、成本高且残留的有机试剂对人体健康和生活环境均有害，不适合工业化应用；从天然或人工培育的子实体中提取，子实体生长周期长且虫草素含量低，生产成本问题限制了工业化应用。由于对虫草素生物合成途径中的相关酶及其功能研究不够深入，虫草素的生物合成途径尚不明确。因此在液体发酵的基础上，在基因工程层面探索虫草素合成新的可能性，可以实现虫草素的高产。p>
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种用于提高虫草素产量的重组蛹虫草及应用，针对虫草素合成的imp途径进行挖掘探究，挖掘到了三个可能处于imp途径关键节点的酶基因，分别是adss(腺苷琥珀酸合成酶)基因、adsl(腺苷琥珀酸裂解酶)基因以及nt5e(5'-核苷酸酶)基因，它们的催化能力直接决定腺苷酸(amp)转化成核苷以及3’-damp转化成虫草素的效率，对虫草素的产量具有直接的影响，接着通过构建含5'-核苷酸酶基因nt5e、腺苷琥珀酸合成酶基因adss或腺苷琥珀酸裂解酶基因adsl的重组基因工程菌，筛选高产虫草素的工程菌，其中最高产工程菌的发酵液中胞外虫草素产量为野生型蛹虫草的6.28倍，菌丝体胞内虫草素产量为野生型蛹虫草的5.82倍，为进一步筛选蛹虫草优良菌株打下了基础。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种用于提高虫草素产量的重组蛹虫草，所述重组蛹虫草是将外源基因重组质粒转化农杆菌，再用农杆菌侵染蛹虫草，筛选含外源基因的重组蛹虫草；所述外源基因为5'-核苷酸酶nt5e基因、腺苷琥珀酸合成酶adss基因或腺苷琥珀酸裂解酶adsl基因中的一种。
4、进一步，所述5'-核苷酸酶nt5e基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述腺苷琥珀酸合成酶adss基因的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述腺苷琥珀酸裂解酶adsl基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
5、进一步，所述外源基因采用组成型启动子表达，所述组成型启动子由酿酒酵母诱导aro9基因的启动子、酿酒酵母α-信息素多肽mfα1基因与酿酒酵母诱导型启动子fus1依次连接构成，核苷酸序列如seq id no：7所示。fus1p是一种参与交配过程中细胞融合的膜蛋白，控制该蛋白的fus1启动子被α-信息素高度诱导。mfα1基因编码由4条具有13个氨基酸的α-信息素肽组成的前体肽；aro9启动子在芳香族氨基酸存在时表达上调；通过aro9启动子控制mfα1基因，就可以根据芳香族氨基酸的浓度来调节信息素的反应。使用诱导型启动子fus1来控制表达蛹虫草菌体内处于虫草素合成途径关键节点的基因，并在蛹虫草菌体内导入由启动子aro9控制的mfα1基因，构建群体感应系统，就可以通过对芳香族氨基酸的类型和浓度进行动态调控从而过表达多种关键基因。
6、进一步，所述外源基因重组质粒采用双元表达载体为基础载体，所述双元表达载体包括pcambia系列载体，优选pcambia-tcbh1-hph-ptrpc，其核苷酸序列如seq id no：8+seq id no：9连接所示。
7、进一步，所述外源基因重组质粒的构建方法为：将组成型启动子插入双元载体pcambia-tcbh1-hph-ptrpc的pvuii位点至egfp基因前，然后进行线性化，得到线性化载体；将线性化载体与外源基因进行无缝连接，得到所述外源基因重组质粒。
8、进一步，所述蛹虫草为蛹虫草(cordyceps militaris)cm01；农杆菌为根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)agl1。
9、本专利技术还提供一种所述重组蛹虫草在高产虫草素中的应用，所述应用的方法为：将所述重组蛹虫草接种至含200μg/ml潮霉素b的沙氏固体培养基，25℃恒温避光培养4～5d，再挑取菌落接种至含色氨酸的发酵培养基，22～25℃，120～180rpm(优选25℃、180rpm)摇床扩大培养，得到含虫草素的发酵液。
10、进一步，所述色氨酸加入发酵培养基中的浓度为10-50μg/ml。
11、进一步，所述沙氏培养基：蛋白胨10g/l，葡萄糖5g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然；若要配置固体培养基，则再加琼脂粉20g/l；发酵培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，kh2po4 0.5g/l，mgso4·7h2o 0.5g/l，l-甘氨酸1g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。
12、本专利技术含5'-核苷酸酶nt5e基因的重组质粒按如下方法构建而成：
13、s1:将如seq id no：7所示的组成型启动子插入载体pcambia-tcbh1-hph-ptrpc的pvuii位点至egfp基因前，得到质粒pcambia-aro9-mfα1-fus1-tcbh1-hph-ptrpc；
14、s2:以vector-f和vector-r为引物，以步骤s1中的质粒
15、pcambia-aro9-mfα1-fus1-tcbh1-hph-ptrpc为模板，进行pcr扩增，得到线性化载体；
16、s3:以nt5e-f和nt5e-r为引物，以cordyceps militaris cm01的基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到5'-核苷酸酶nt5e基因；
17、s4：将步骤s2所述的线性化载体和s3所述的5'-核苷酸酶nt5e基因(采用无缝连接试剂盒)进行无缝连接，得到含5'-核苷酸酶nt5e基因的重组质粒。
18、本专利技术所述含腺苷琥珀酸合成酶adss基因的重组质粒按如下方法构建而成：
19、s1:将如seq id no：7所示组成型启动子插入载体pcambia-tcbh1-hph-ptrpc的pvuii位点至eg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于提高虫草素产量的重组蛹虫草，其特征在于，所述重组蛹虫草是将外源基因重组质粒转化农杆菌，再用农杆菌侵染蛹虫草，筛选含外源基因的重组蛹虫草；所述外源基因为5'-核苷酸酶NT5E基因、腺苷琥珀酸合成酶ADSS基因或腺苷琥珀酸裂解酶ADSL基因中的一种。
2.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述5'-核苷酸酶NT5E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述腺苷琥珀酸合成酶ADSS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述腺苷琥珀酸裂解酶ADSL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述外源基因采用组成型启动子表达，所述组成型启动子由酿酒酵母诱导ARO9基因的启动子、酿酒酵母α-信息素多肽mfα1基因与酿酒酵母诱导型启动子FUS1依次连接构成。
4.如权利要求3所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
5.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述外源基因重组质粒采用双元表达载体为基础载体，所述双
6.如权利要求1-5之一所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述外源基因重组质粒的构建方法为：将组成型启动子插入双元载体pCAMBIA-Tcbh1-hph-PtrpC的PvuII位点至EGFP基因前，然后进行线性化，得到线性化载体；将线性化载体与外源基因进行无缝连接，得到所述外源基因重组质粒。
7.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述蛹虫草为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)CM01；农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1。
8.一种权利要求1所述重组蛹虫草在高产虫草素中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将所述重组蛹虫草接种至含200μg/mL潮霉素B的沙氏固体培养基，25℃恒温避光培养4～5d，再挑取菌落接种至含色氨酸的发酵培养基，22～25℃，120～180rpm摇床扩大培养，得到含虫草素的发酵液；发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，L-甘氨酸1g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述色氨酸加入发酵培养基中的浓度为10-50μg/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种用于提高虫草素产量的重组蛹虫草，其特征在于，所述重组蛹虫草是将外源基因重组质粒转化农杆菌，再用农杆菌侵染蛹虫草，筛选含外源基因的重组蛹虫草；所述外源基因为5'-核苷酸酶nt5e基因、腺苷琥珀酸合成酶adss基因或腺苷琥珀酸裂解酶adsl基因中的一种。
2.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述5'-核苷酸酶nt5e基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述腺苷琥珀酸合成酶adss基因的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述腺苷琥珀酸裂解酶adsl基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
3.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述外源基因采用组成型启动子表达，所述组成型启动子由酿酒酵母诱导aro9基因的启动子、酿酒酵母α-信息素多肽mfα1基因与酿酒酵母诱导型启动子fus1依次连接构成。
4.如权利要求3所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述组成型启动子的核苷酸序列如seq id no：7所示。
5.如权利要求1所述的重组蛹虫草，其特征在于，所述外源基因重组质粒采用双元表达载体为基础载体，所述双元表达载体为pcambia-tcbh1-hph-ptrpc，其核苷酸序列如seq idno：8+seq idno：9连接所示。
6.如...
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