一种利用发根农杆菌介导月季叶片产生转基因根系及基因定位鉴定的方法技术

一种利用发根农杆菌介导月季叶片产生转基因根系及基因定位鉴定的方法，包括以下步骤：构建目标基因的过表达载体，反应产物转化大肠杆菌后，采用LB固体培养基筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒，得到含有目的基因的过表达重组质粒；将含有目的基因的过表达重组质粒转化发根农杆菌，在YEB固体培养基上筛选阳性克隆，在YEB固体培养基上进行划线培养得到发根农杆菌菌块；或摇菌到对数增长期，OD<subgt;600</subgt;＝0.6～0.8，即所得菌液离心后沉淀用，用1/2MS重新悬浮，调整OD600＝0.8，得到供侵染的发根农杆菌重悬菌液；采用发根农杆菌菌块或重悬菌液侵染月季叶片；培养后利用手持紫外灯进行阳性根系筛选，利用激光共聚焦鉴定目标基因位置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程，具体涉及一种利用发根农杆菌介导的月季叶片产生转基因根系及基因定位鉴定的方法。

技术介绍

1、鉴定基因在细胞中的位置是研究基因功能的重要手段及必要前提。目前，国内外常用的基因功能定位的验证的手段多采用烟草等常规模式植物进行的瞬时转化系统。但是不同物种间基因的调控及定位还是存在明显的差异性的。所以利用本体植物进行基因定位数据更加真实可靠。但是由于月季叶片较厚存在蜡质层，常规的注射手段很难将目的基因导入。而抽真空的方式会对植物造成一定的伤害。即使目的基因成功导入，由于叶片组织叶绿素含量比较高，容易与绿色荧光重叠，很难观测到基因所携带的荧光标签。而且对于需要长时间进行定位观测及动态变化的基因，瞬时转化基因表达时间短很难满足这一要求。

2、此外，对没有组培条件的或者不能组培的月季材料，叶片较容易获得。但如何使月季叶片产生转基因阳性根，目前暂无报导。

3、因此，本专利技术提供了一种基于月季发根农杆菌介导月季叶片产生稳定转基因根系及基因定位鉴定方法，该方法利用发根农杆菌转化技术，促进月季叶片产生阳性根系，利用手持紫外灯进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种利用发根农杆菌介导月季叶片产生转基因根系及基因定位鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述过表达载体为pFAST-R05，或携带荧光蛋白的过表达载体，所述荧光蛋白为GFP。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述LB固体培养基含有壮观霉素抗性，壮观霉素的浓度为100mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述发根农杆菌为MSU440，YEB固体培养基含有壮观霉素、链霉素，壮观霉素的浓度为100mg/L，链霉素的浓度为50mg/L。

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【技术特征摘要】

1.一种利用发根农杆菌介导月季叶片产生转基因根系及基因定位鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述过表达载体为pfast-r05，或携带荧光蛋白的过表达载体，所述荧光蛋白为gfp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述lb固体培养基含有壮观霉素抗性，壮观霉素的浓度为100mg/l。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述发根农杆菌为msu440，yeb固体培养基含有壮观霉素、链霉素，壮观霉素的浓度为100mg/l，链霉素的浓度为50mg/l。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述浸染方法为以组培用手术刀蘸取重悬菌液，在完整带柄复叶的月季无菌苗叶柄、叶片划伤；侵染后，用滤纸吸干外植体表面菌液，在黑暗中共培养2～3d；侵染后，用滤纸吸干外植体表面菌液，在黑暗中共培养2～3d；共培养基：1/2ms+30g/l蔗糖+3.0g/l植物凝胶，ph 5.8～6.0；共培养后再诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晶晶，王长泉，黄煜雯，袁国振，刘金义，陆俊，刘虹池，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：