【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养，涉及油茶单倍体组培苗的创制，具体涉及一种油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法。
技术介绍
1、油茶是我国南方特有的木本油料树种，其种仁含油量为45％-60％，榨取的茶油色清味香，是一种优质食用油，其不饱和脂肪酸含量可达90％以上，以油酸和亚油酸为主，还富含维生素e、山茶皂苷、多酚、角鲨烯等功能活性成分，长期食用会降低血压血脂从而预防高血压和心血管疾病，具有提高免疫力，延缓衰老等医疗保健作用。近年来国家相关部门十分重视油茶产业发展，现已被列为重点发展的木本油料树种。我国现有油茶种植面积已达到453.33万公顷，并形成千亿产值规模，但我国油茶林大部分为中低产林，良种推广面积占比仅为45.7％。油茶品种良莠不齐，严重制约了油茶产业的快速发展，加快良种繁育是发展油茶产业的重中之重。
2、油茶是一种高倍性的多年生异花授粉的木本植物，常规的杂交育种和自然选育周期长、效率低。利用单倍体培养技术可以快速获得遗传稳定的纯合单倍体育种中间材料，节约育种时间与工作量，提高育种速度与效率。前期研究人员进行了大量油茶花药培养研究，尝试通过这一方法培育油茶单倍体，但所有研究都只获得了花药愈伤组织，未能培育出油茶单倍体植株。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法。传统油茶育种方法周期长、效率低，单倍体培养技术虽可提高效率，但油茶基础研究薄弱，花药培养方法应用较难。本专利技术利用辐射花粉进行杂交授粉，并及时对获
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、一种油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，包括以下步骤：
4、(1)采集花粉，用60-co辐射源对花粉进行辐射。
5、(2)测定辐射花粉的活力与萌发率。
6、(3)用活力与萌发率高的辐射花粉对母本进行授粉，授粉后套袋，授粉一周后解袋。
7、(4)翌年采集果实，在2℃～8℃的环境中经3～7天的低温处理，从种子中取出幼胚，将幼胚向下插入到萌发培养基(wpm+0.5～3.0mg/l 6-ba+0～1.0mg/lnaa+20～50g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～6.0)中。幼胚接种后在温度26～30℃、黑暗条件下培养20～30d天后转入光照条件下培养60～80d诱导成苗。这一步骤中，有的幼胚能够通过早熟萌发直接成苗，有的幼胚会诱导出胚性愈伤组织。
8、(5)将步骤(4)未早熟萌发成苗的材料接种到胚性愈伤组织诱导培养基(wpm+0.1～2.0mg/l 6-ba+0.1～1.0mg/l naa+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8)中培养进行胚性愈伤组织的诱导，将获得的胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织增殖培养基(ms+0～1.0mg/l2,4-d+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8)中进行增殖培养。之后接种到球形胚诱导培养基(ms+0～1.5mg/l 2,4-d+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8)上，培养20～35d后转入心形胚诱导培养基(wpm+1.0～3.0mg/l 6-ba+0.1～1.0mg/l naa+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8)上，培养5～15d后转入子叶胚诱导培养基(wpm+1.0～3.0mg/l6-ba+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8)上，培养15～30d后转入成苗培养基(ms+1.0～3.0mg/l 6-ba+0.1～1.0mg/l naa+0.1～3.0mg/l核黄素+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8)上培养20～40d诱导成苗。
9、(6)将步骤(4)、(5)得到的苗接到幼苗增殖培养基中进行幼苗增殖培养，得到再生植株。所述的幼苗增殖培养基的组成为：ms+1.0～3.0mg/l 6-ba+0.5～1.5mg/l iba+20～40g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.5～5.8。
10、(7)对再生植株进行倍性鉴定，筛选单倍体植株。
11、步骤(1)具体为：采集未散粉花朵，剥好花药后烘干至散粉，用100-1500gy的60-co进行辐射。其中，烘干的温度为28-30℃。
12、步骤(2)中，花粉活力的测定方法包括以下步骤：将花粉加入到fda(二乙酸荧光素)测定液摇匀后黑暗染色，将染色后的花粉液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下进行花粉活力观察。所述fda测定液的配制为先配制5mg/ml fda原液(溶剂：丙酮)，后用20％蔗糖溶液稀释50倍。
13、步骤(2)中，花粉萌发率的测定方法包括以下步骤：将花粉均匀撒播于萌发培养基表面，封口后置于25℃的恒温箱中培养4h，在倒置显微镜下观察花粉萌发情况。所述萌发培养基为1％琼脂+10％蔗糖+0.01％硼酸。
14、步骤(4)中，所述的萌发培养基的组成优选为：wpm+2.0mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6-5.8。
15、步骤(5)中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基的组成优选为：wpm+1.0mg/l6-ba+0.5mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8；所述的胚性愈伤组织增殖培养基的组成优选为：ms+0.7mg/l 2,4-d+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
16、步骤(5)中，所述的球形胚诱导培养基的组成优选为：ms+0.5mg/l 2,4-d+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
17、步骤(5)中，所述的心形胚诱导培养基的组成优选为：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
18、步骤(5)中，所述的子叶胚诱导培养基的组成优选为：wpm+2.0mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
19、步骤(5)中，所述的成苗培养基的组成优选为：ms+2.0mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+1.0mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
20、步骤(6)中，所述的幼苗增殖培养基的组成优选为：ms+2.0mg/l 6-ba+1.0mg/liba+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
21、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
22、(1)本专利技术创新了油茶单倍体育种方法。现有的油茶单倍体研究均限于花药培养，且始终未能突破再生瓶颈、未能成功培育出油茶单倍体。而本专利技术通过辐射花粉授本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(1)为：采集未散粉花朵，剥好花药后烘干至散粉，用100-1500Gy的60-Co进行辐射。
3.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(2)中，花粉活力的测定方法包括以下步骤：将花粉加入到FDA测定液摇匀后黑暗染色，将染色后的花粉液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下进行花粉活力观察；
4.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的萌发培养基的组成为：WPM+2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH 5.6-5.8。
5.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基的组成为：WPM+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH 5.6～5.8；所述的胚性愈伤组织增殖培养基的组成为：MS+0
6.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的球形胚诱导培养基的组选为：MS+0.5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH 5.6～5.8。
7.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的心形胚诱导培养基的组成为：WPM+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH 5.6～5.8。
8.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的子叶胚诱导培养基的组成为：WPM+2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH5.6～5.8。
9.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的成苗培养基的组成为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1.0mg/L核黄素+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH 5.6～5.8。
10.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的幼苗增殖培养基的组成为：MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂、pH 5.6～5.8。
...【技术特征摘要】
1.一种油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(1)为：采集未散粉花朵，剥好花药后烘干至散粉，用100-1500gy的60-co进行辐射。
3.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(2)中，花粉活力的测定方法包括以下步骤：将花粉加入到fda测定液摇匀后黑暗染色，将染色后的花粉液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下进行花粉活力观察；
4.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的萌发培养基的组成为：wpm+2.0mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6-5.8。
5.根据权利要求1所述的油茶辐射花粉授粉诱导单倍体的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基的组成为：wpm+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8；所述的胚性愈伤组织增殖培养基的组成为：ms+0.7mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、ph 5.6～5.8。
6.根据权利要求1所述的油茶辐...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖诗鑫，徐向帅，袁德义，韩春霞，李艳民，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：
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