单胺氧化酶MAO单试剂测定试剂盒制造技术

本申请公开了一种单试剂检测血清中单胺氧化酶ＭＡＯ的诊断试剂盒。该试剂盒利用单胺氧化酶水解苄胺、丁基胺、戊基胺、β－苯乙基胺等胺类化合物产生氨，再偶联谷氨酸脱氢酶反应，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，通过测定３４０ｎｍ处吸光度的下降速度，定量反应出样本中单胺氧化酶活性的大小，另外本申请在体系中加入能缓慢生成还原型烟酰辅酶所需的酶和底物系统，在试剂中形成酶－底物－辅酶的慢反应系统，使得辅酶能缓慢循环补充，当浓度达到一定平衡的时候，就可以使试剂达到稳定的目的。这种单试剂的试剂盒使用方便、简洁，可以在普通紫外／可见光分析仪或者半自动／全自动生化分析仪上快速检测，不需要特殊或者额外的仪器，其成本也低廉。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及酶法单试剂测定单胺氧化酶活性的方法及试剂盒的 制法。
技术介绍
单胺氧化酶(MAO)能反映纤维化的生化过程，是反映肝纤维 化及肝细胞损害的重要指标，在肝硬化的诊断上越来越受到重视。MAO是含铜的蛋白质，广泛存在于肝、肾、脑等器官的结缔组 织巾和细胞线粒体内，其分布肝>心〉肾>鹏1>肺>骨骼肌，血.小板和胎 盘中也含有MAO，其同工酶有三种，分别为MAO—I、 MAO—II 和MAO—III，有两个亚单位MA0—A和MA0—B。通过同源序列分析， 发现单胺氧化酶有四个高度保守的区域。在单胺氧化酶B中，这些保守区域包括1) ADP结合位点；2)底物结合结构域；3)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)共价结合位点；4) C端区域，主要与形成一个跨 膜相关的a螺旋。MA0是可以作用于不同单胺类化合物的水溶性酶，参与胶原成 熟最后阶段的架桥形成。当纤维形成后，MAO脱离，从而导致血清 中MAO活性升高。肝病患者因肝内慢性炎症性刺激而产生纤维结缔 组织增生，最终导致肝纤维化。由于在此过程中胶原合成增多，所以 血清中MAO活性增加与肝纤维化程度正相关。现有的测定技术中，其测定的主要方法有荧光法、免疫抑制法 和化学分光光度法。荧光法是以P —苯乙基胺为底物来检测单胺氧化 酶。免疫学方法是利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生发应，检测 生成的单胺氧化酶的同工酶。分光光度法是通过用单胺氧化酶催化胺 类释放出过氧化氢去氧化10—N—甲基氨基甲酰基一3， 7 — 二甲氨基4—IO —氢一吩噻嗪(MCDP)等发色剂进行测定。目前，主要以苄胺和 对苯甲胺一 3 —偶氮萘酚作为底物。目前市场上主要使用的测定MAO的技术是使用采用双试剂试剂盒的方法，这是因为双试剂的试剂盒通过控制酸碱度，可以增加试剂 的稳定性。但是由于所采用的双试剂占用更多的试剂舱位，并且在半 自动的仪器上操作繁琐，耗时长，所以限制了它们的实用性。因此，目前还存在开发快速、操作简单、具有良好检测效果，并 且可以在多种检测仪器中使用的试剂盒的需要。本专利申请提供了一种单试剂诊断MAO的试剂盒，以及配制该试剂盒的方法。本申请提 供的试剂盒能广泛应用于各种检测仪器中对单胺氧化酶活性进行检 测，通过在反应体系中偶联一个再生循环酶系统，缓慢补充辅酶的量， 从而确保了试剂的稳定性及临床测值的准确性。另夕卜，本申请提供的 单试剂占用的舱位少，操作简便，使用方便，灵敏度高，抗干扰能力 强，具有测定速度快，准确度高，试剂稳定等效果。
技术实现思路
因此，为了克服目前在检测MA0领域屮存在的如上所述的诸多问 题，本中请提供一种稳定的测定血清、血浆中单胺氧化酶活性的单试 剂的试剂盒。本专利技术提供了 -- 种包括50 — 250mM，pH 7. 0-10的缓冲液、5 — 30mM 的胺类化合物、5-20mM的a —酮戊二酸、0. 2 — 0. 4mM的还原型辅酶、 0. 2 — 5Ku的谷氨酸脱氢酶的测定单胺氧化酶活性的单试剂试剂盒， 其还包括由再生系统酶、底物和辅酶组成的再生酶循环系统。该再生 酶循环系统包括浓度为5 — 100mM的底物、10 — 1000u的系统酶。本申请所述的再生酶循环系统的反应速率小于主反应的速率，不 干扰主反应。本申请优选的再生酶循环系统包括葡萄糖脱氢酶一葡萄 糖一还原型辅酶或其类似物系统、葡萄糖6磷酸脱氢酶一葡萄糖6磷 酸一还原型辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶—甘油—还原型辅酶或 其类似物系统、乳酸脱氢酶一丙酮酸一还原型辅酶或其类似物系统； 或者葡萄糖脱氢酶一葡萄糖一氧化型辅酶或其类似物系统、葡萄糖6磷酸脱氢酶一葡萄糖6磷酸一氧化型辅酶或其类似物系统、甘油脱氢 酶一甘油一氧化型辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶一丙酮酸一氧化 型辅酶或其类似物系统。本申请优选的氧化型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物，优选的 还原型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物相应的还原型烟酰辅酶或其类似物。更优选的氧化型烟酰辅酶或其类似物是NAD、 NADP、 thio-NAD或thio-NADP，更优选的还原型烟酰辅酶或其类似物是 NADH、 NADPH、 thio-NADH或thio-NADPH。特别地，本申请提供的试剂盒中所述的胺类化合物选自苄胺、丁 基胺、戊基胺、P—苯乙基胺、酪胺或其衍生物。所述的缓冲液选自 三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液、三乙醇氨缓冲液、咪唑一盐酸缓冲 液、双甘氨肽缓冲液、碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液、硼酸一硼酸钠缓冲 液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液或者磷酸本申请提供的试剂盒优选地还包括0. 1-3g/L的螯合剂、 0. 1-3g/L的防腐剂、1-30%的稳定剂、0. l一5g/L的表面活性剂、0. 1 一5mM的反应加速剂；所述的稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、'牛血 清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、乳糖、黄素腺嘌呤二 核苷酸和黄素单核苷酸中的一种或几种；所述的表面活性剂是阳离子 表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂。另一方面，本申请提供的再生酶循环系统还用于制备检测二氧化 碳、腺苷脱氨酶、氨、肌酐、尿素、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸 氨基转移酶的单试剂试剂盒中。本申请的有益效果主要表现在1)该方法所配制试剂为单一试 剂，所以使用方便，操作简单；2)该试剂可在全自动生化分析仪上 快速检测，也可在半自动或者手动仪器上使用，所以便于推广应用； 3)参与偶联反应的成分都是外加的，不会引入额外的内外源物质的 污染；4)本申请偶联的再生酶循环系统速率要小于主反应的速率， 不干扰主反应；5)本申请配制的单试剂试剂盒，稳定性好，可以长 时间使用，37度稳定性实验证明一年半后空白吸光度A0X). 8。6目前市场上存在的检测MAO的试剂盒均为双试剂的试剂盒。本申 请则提供了 一种为单试剂的试剂盒。在设计本申请时需要考虑的几个问题是1) 根据选择的底物选定单胺氧化酶测定的最适反应条件，如缓 冲液的浓度，离子强度和PH等等；2) 还原型辅酶的最适稳定pH及辅酶再生循环系统的慢反应pH;3) 样本中氨干扰的去除；4) 整个体系的稳定性问题；5) 兼顾上述所有条件下的反应速率问题。在此基础上，本申请人公开了一种用于检测MA0的单试剂的试剂盒。在本申请的一个具体实施方案中，所述试剂盒主要采取以下的方法及歩骤首先，将需要测定的样品与含有胺类化合物、a —酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶及再生酶循环系统的各种物质混匀，使之发 生以下反应，单胺氧化酶胺类化合物+ 2水+氧-------^相应醛类产物+铵离子+过氧化氢+ 20H谷氨酸脱氢酶铵离子+ a —酮戊二酸+还原型辅酶-------^谷氨酸+氧化型辅酶+水相应葡萄糖脱氢酶氧化型辅酶+葡萄糖类底物-------^还原型辅酶十相应醛+水然后，将反应后的混合物在全自动生化分析仪上，检测340nm处 吸光度的下降速度，从而测算出单胺氧化酶的活性大小。本申请的试剂盒还包括一种在单试剂制备中的再生酶循环系统， 通过在检测试剂中加入指示性辅酶的生成补充体系，利用反应的可逆 性，由产物逆向生成原反应物，从而补充原反应物的量。该试剂盒通7酶循环系统，从而从技术上确保了单 试剂中各组分在制备、储存和应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定单胺氧化酶活性的单试剂试剂盒，包括５０－２５０ｍＭ，ｐＨ７．０－１０的缓冲液、５－３０ｍＭ的胺类化合物、５－２０ｍＭ的α－酮戊二酸、０．２－０．４ｍＭ的还原型辅酶、０．２－５Ｋｕ的谷氨酸脱氢酶，其特征在于还包括由再生系统酶、底物和辅酶组成的再生酶循环系统。

【技术特征摘要】
1、一种测定单胺氧化酶活性的单试剂试剂盒，包括50—250mM，pH7.0-10的缓冲液、5—30mM的胺类化合物、5-20mM的α—酮戊二酸、0.2—0.4mM的还原型辅酶、0.2—5Ku的谷氨酸脱氢酶，其特征在于还包括由再生系统酶、底物和辅酶组成的再生酶循环系统。2、 根据权利要求1的试剂盒，其中所述的再生酶循环系统包括浓度 为5 — 100mM的底物、10 —1000u的系统酶。3、 根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于所述的再生酶循环系 统的反应速率小于主反应的速率，不干扰主反应。4、 根据权利要求1或2的试剂盒，其中所述的再生酶循环系统包括 葡萄糖脱氢酶一葡萄糖一还原型辅酶或其类似物系统、葡萄糖6磷酸 脱氢酶一葡萄糖6磷酸一还原型辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶一 甘油一还原型辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶一丙酮酸一还原型辅 酶或其类似物系统；或者葡萄糖脱氢酶一葡萄糖一氧化型辅酶或其类 似物系统、葡萄糖6磷酸脱氢酶一葡萄糖6磷酸一氧化型辅酶或其类 似物系统、甘油脱氢酶一甘油一氧化型辅酶或其类似物系统、乳酸脱 氢酶一丙酮酸一氧化型辅酶或其类似物系统。5、 根据权利要求4的试剂盒，其特征在于所述的氧化型辅酶是氧化 型烟酰辅酶或其类似物，还原型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物相 应的还原型烟酰辅酶或其类似物。6、 根据权利要求5的试剂盒，其特征在于氧化型烟酰辅酶或其类似 物是NAD、 NADP、 thio-NAD或thio-NAD...

【专利技术属性】
技术研发人员：温云飞，
申请(专利权)人：北京九强生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]