【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及一种检测裂谷热病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒。
技术介绍
1、裂谷热(rift valley fever virus,rvf)是由裂谷热病毒(riftvalley fevervirus,rvfv)引起的一种蚊媒性人兽共患病，感染可导致反刍动物母畜流产、幼畜高死亡率和人类的出血热。rvf于1930年在非洲大陆被首次发现并报道，目前已传播到了多个地区，如马达加斯加、科摩罗群岛、沙特阿拉伯和也门等。rvf被世界动物卫生组织列为法定报告疾病，与非洲以及中东地区贸易往来日益密切，裂谷热输入风险不容忽视。
2、rvfv是布尼亚病毒目(bunyavirales)白纤病毒科(phenuiviridae)白蛉病毒属(phlebovirus)的成员，基因组大小约为12kb，rvfv基因组为单股负链rna，可分为l(大)、m(中)、s(小)3个节段；其中，s节段长1690bp，通过双义翻译机制编码2种蛋白，以负义的方式编码核糖蛋白(nucleoglucapsidprotein,np)，以正义的方式编码非结构蛋白(non-structural protein s segment,nss)。非结构蛋白nss是病毒复制非必需蛋白，是病毒重要的毒力因子，功能主要包括：通过多种途径在转录和翻译水平上干扰宿主干扰素的产生，抑制宿主细胞的天然抗病毒活性；在细胞核内形成纤维化结构，与宿主染色体dna相互作用，使染色体的凝聚和解离产生缺陷。rvfvnp由735个核苷酸编码，分子量约为27.4kda，是高度保守的结构
3、绵羊是最易受感染的动物，rvf的潜伏期为24～36h，临床表现为发热、无精打采、食欲不振、腹痛和血性腹泻。组织病理表现为多灶型肝坏死，偶有脾肿大。实验性感染后的成年绵羊死亡率在20～30％；新生羔羊的死亡率可达95～100％；急性感染的怀孕母羊流产几率为100％。肝脏是rvfv感染后受损伤最明显的器官，对感染病毒后的肝脏进行组织病理学检查，结果显示患病动物表现为多灶性病变和坏死性肝炎。肝坏死是最明显的病变，具体表现为肝脏正常结构大量丧失，出现杆状或椭圆形的嗜酸性核内包涵体，进行详细检测后可发现肝内部含有大量的rvfvnss蛋白。与此同时，脾脏也会显示不同程度的坏死。肝脏受损可导致黄疸和出血热疾病，血清生化指标中显示肝酶天冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase，ast)和丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，alt)的升高(hartman etal.,2014；swanepoel et al.,1979；al-hazmi et al.,2003)。血红蛋白含量和血小板计数随着凝血时间的增加而降低，出现出血热的患者，通常病愈率低死亡率高，在出现症状后一到两周内死亡。rvfv侵入机体后，通过淋巴导管转运到外周淋巴结，在淋巴结复制后进入循环系统，产生最初的病毒血症，进一步感染重要的靶器官，如肝脏、脾、肾以及脑部。病毒在靶器官继续复制，引起高浓度的病毒血症，严重病例会出现特征性出血和血清生化指标的改变。高病毒血症在感染后2～3d达到高峰，然后在4～5d突然下降，这是反刍动物急性rvfv感染的一个显著特征。一般来说，受感染的动物在这几天要么死亡，要么完全康复。在感染过程中，病毒通过nss蛋白的抗干扰素作用，抑制宿主的天然抗病毒免疫应答。在获得性免疫应答中，体液免疫发挥着重要功能，感染4～8d，机体即产生针对糖蛋白gn/gc的中和性抗体，np具有很强的免疫原性，能够诱导体液和细胞免疫，但产生的抗体不具有中和活性。np是rvfv感染动物机体后产生的免疫优势抗原，与病毒粒子中的基因组rna紧密结合，影响病毒基因组的组装，因此，对rvfvnp的研究十分必要。
4、目前，国内外尚无获批的商品化诊断试剂盒。rvf的抗原检测多通过直接免疫荧光技术对感染细胞中的rvfv进行特异性鉴定。除此之外，paweska等人建立了双抗体夹心elisa用于检测细胞培养的rvfv(paweska j t，barnard b j，williams r j.the use ofsucrose-acetone-extracted riftvalley fever virus antigen derived from cellculture in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay andhaemagglutination-inhibition test[j].1995，62(4)：227.)。较于抗原检测，核酸和抗体检测在rvf的诊断中应用更为广泛。现阶段who推荐的rvfv核酸检测方法为反转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，rt-pcr)，但此类方法需要仪器设备，不适合基层现场诊断。抗体检测方法中常将病毒中和试验作为金标准，但是该方法需利用活病毒进行检测，rvfv需在生物安全ⅲ级实验室操作，操作平台受限且生物安全风险高。目前，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay，elisa)是动物制品进出口检疫常用方法，也是世界范围内应用最广的一种检测方法。paweska等人于1995年利用细胞培养的病毒作为抗原，建立了rvfv igg捕获elisa抗体检测方法，该方法已被oie推荐为检测该病毒的标准方法之一。jackel等人于2013年利用原核表达系统制备了rvfvegn蛋白，并利用该蛋白建立了可用于检测小型反刍动物中rvfv igg的间接elisa检测方法。upreti等人于2018年利用重组np蛋白作为抗原，建立了rvfv竞争elisa抗体检测方法，其敏感性为95.1％，特异性为91.8％(upreti d，cernicchiaro n，richt ja，etal.preliminary evaluation ofdiagnostic accuracy andprecision ofa competitiveelisa for detection ofantibodies to riftvalley fever virus in cattle andsheep sera[j].jvirol methods，2018，262：6-11)。除elisa方法外，van等人于2012年利用昆虫表达载体pmt/bip/v5-hisa表达egn蛋白，以此为基础建立了一种可同时检测rvfvnp蛋白和gn蛋白的液相芯片检测方法，此方法可区别动物感染是自然感染或通过接种疫苗而感染。
5、裂谷热属于烈性人兽共患病，被世界动物卫生组织认定为a类传染病，一旦输入我国，会给畜牧业带来巨大经济损失。目前我国尚无商品化的，快速、准确的血本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分泌抗裂谷热病毒(RVFV)NP的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为RVFV NP-5D8杂交瘤细胞，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号为CGMCC NO.45822，保藏时间为2024年3月1日。
2.一种抗RVFV NP的单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌获得，所述抗体命名为5D8 MAb，所述的杂交瘤细胞株命名为RVFV NP-5D8杂交瘤细胞，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号为CGMCC NO.45822，保藏时间为2024年3月1日。
3.一种单克隆抗体在制备检测或诊断裂谷热病毒感染试剂中的用途，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌获得。
4.一种检测裂谷热病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求2所述的单克隆抗体以及兔抗RVFV NP多克隆抗体，其中所述的单克隆抗体进行HRP标记后作为检测抗体，标记后的检测抗体命名为5D8-HRP，兔抗RVFV NP多克隆抗体作为捕获抗体。
5.如
6.如权利要求4所述的检测裂谷热病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述兔抗RVFV NP多克隆抗体，包被量为0-0.5μg/孔。
7.如权利要求4所述的检测裂谷热病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述兔抗RVFV NP多克隆抗体，包被量为0-0.2μg/孔。
8.如权利要求4所述的检测裂谷热病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述的检测抗体为5D8-HRP，检测抗体的量为0-2.24ng/孔。
...【技术特征摘要】
1.一种分泌抗裂谷热病毒(rvfv)np的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为rvfv np-5d8杂交瘤细胞，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号为cgmcc no.45822，保藏时间为2024年3月1日。
2.一种抗rvfv np的单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌获得，所述抗体命名为5d8 mab，所述的杂交瘤细胞株命名为rvfv np-5d8杂交瘤细胞，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号为cgmcc no.45822，保藏时间为2024年3月1日。
3.一种单克隆抗体在制备检测或诊断裂谷热病毒感染试剂中的用途，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌获得。
4.一种检测裂谷热病毒的双抗体夹心elisa试剂盒，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟功勋，步志高，陶丽红，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：
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