磷脂转移酶活性升高的脂酰基转移酶变体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种磷脂转移酶活性升高的脂酰基转移酶变体，其包含氨基酸序列基序ＧＤＳＸ，其中Ｘ是下列氨基酸残基中的一种或多种：Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、或Ｓ，其中所述酶变体相对于亲本序列在本发明专利技术所描述的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸。本发明专利技术还涉及使用该磷脂转移酶活性升高的脂酰基转移酶变体制作食品的方法、使植物油或食用油酶促脱胶的方法，以及涉及该脂酰基转移酶变体用于降低食用油中磷脂含量的工艺中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于生成酶变体的方法。本专利技术还涉及新型酶变体以及这 些新型酶变体的用途。
技术介绍
月旨胆固醇酰基转移酶为人所知已有 一 些时间(见例如Buckley, Biochemistry, 1983， 22， 5490-5493 )。具体而言，已经发现了甘油磷月旨 胆固醇酰基转移酶(GCAT),它像植物和/或哺乳动物卵磷脂:胆固醇酰基 转移酶(LCAT) —样，催化磷脂酰胆碱与胆固醇之间的脂肪酸转移。Upton和Buckley( TIBS， 1995年5月20日，178-179 )以及Bmmlik和Buckley (J. of Bacteriology, 1996年4月，2060-2064 )讲授了来自嗜水气单胞菌 Uerawoos/z;^ra; /n7a )的一种脂肪酶/酰基转移酶，它能够在水性介质中 将酰基转移给醇受体。已经对嗜水气单胞菌酰基转移酶鉴定了这种酶的推定底物结合结构域和活性位点(见例如Thornton等，1988, Biochem. et Biophys. Acta. 959, 153-159;以及Hilton和Buckley， 1991, J. Biol. Chem. 266, 997-1000)。Buckley等人(J. Bacteriol. 1996， 178(7)， 2060-4 )讲授了 Serl6、 Aspl 16、 和His291是维持酶活性所必须保留的必需氨基酸。Robertson等人(J. Biol. Chem. 1994， 269, 2146-50 )讲授了嗜水气单胞 菌酰基转移酶的一些具体突变，即Y226F、 Y230F、 Y30F、 F13S、 S18G、 S18V,它们都不是本专利技术所涵盖的。专利技术概述本专利技术是基于含GDSX脂酰基转移酶的特殊变体的发现而建立的，这些 变体的转移酶活性比亲本酶升高。具体而言，依照本专利技术的变体具有比亲 本酶升高的使用半乳糖脂作为酰基供体的转移酶活性。这些脂酰基转移酶 在本文中称为糖脂酰基转移酶(glycolipid acytransferase)。依照本专利技术的变体 可以额外具有比亲本酶升高的使用半乳糖脂作为酰基供体的转移酶活性与 磷脂转移酶活性比率(GL:PL比)和/或升高的使用半乳糖脂作为酰基供体 的转移酶活性与半乳糖脂水解活性比率(GLt:GLh比)。依照第 一个方面，本专利技术提供了用于生成糖脂酰基转移酶变体的 一种 方法，包括(a)选择特征为包含氨基酸序列基序GDSX的脂酰基转移酶作为 亲本酶，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、 A、 V、 I、 F、 Y、H、 Q、 T、 N、 M、或S; (b)更改一个或多个氨基酸以生成脂酰基转移酶变 体；(c)在半乳糖脂底物，和任选磷脂底物和/或任选甘油三酯底物上测试脂 酰基转移酶变体的活性；(d)选择对半乳糖脂的活性比亲本酶升高的酶变体； 并任选(e)制备一定量的酶变体。在另 一个方面，本专利技术提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的一种 糖脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、 A、 V、I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M、或S,且其中酶变体相对于亲本序列在(下文 限定的)第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多个氨基酸残 基处包含一个或多个氨基酸更改。在还有一个方面，本专利技术提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的一 种糖脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M、或S，且其中酶变体相对于亲本序列在(下 文限定的)第2组(set2)、第4组(set4)、第6组(set 6)、或第7组(set 7)限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述组是通过结构对比所述亲本序列与本文限定的P10480结构模型而鉴定的，优选是通 过如本文所讲授的结构对比P10480晶体结构坐标与1IVN.PDB和/或 IDEO.PDB而获得的。本专利技术还提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的 一种糖脂酰基转 移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M、或S，且其中酶变体相对于亲本序列在(下文限定的) 第2组讲授的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所 述第2组是如所讲授的对比所述亲本序列与pfam共有序列(SEQIDNo. 1) 而鉴定的并依照P10480的结构模型更改以确保最佳符合交叠(best fit overlap) (见图55)。依照还有一个方面，本专利技术提供了一种糖脂酰基转移酶变体，其中酶 变体包含SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3 、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5 、 SEQ ID No. 6、 SEQIDNo. 12、 SEQIDNo. 14、 SEQIDNo. 16、 SEQIDNo. 18、 SEQ ID No. 20、 SEQIDNo, 22、 SEQIDNo. 24、 SEQIDNo, 26、 SEQIDNo. 28、 SEQIDNo. 30、 SEQIDNo, 33、 SEQ ID No. 34、 SEQIDNo. 36、 SEQIDNo. 37、 SEQIDNo. 39、 SEQ ID No. 41、 SEQ ID No. 43、或SEQ ID No. 45所示 氨基酸序列，只是在(下文限定的)第2组、第4组、第6组、或第7组限定 的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述组是通 过与SEQ ID No. 2序列对比而鉴定的。在还有一个方面，本专利技术提供了一种糖脂酰基转移酶变体，其中酶变 体包含SEQIDNo. 2、 SEQIDNo. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQIDNo. 5、 SEQ ID No. 6、 SEQIDNo. 12、 SEQIDNo. 14、 SEQIDNo. 16、 SEQIDNo. 18、 SEQ ID No. 20、 SEQIDNo. 22、 SEQ ID No. 24、 SEQ ID No. 26、 SEQIDNo. 28、 SEQIDNo. 30、 SEQIDNo. 33、 SEQIDNo. 34、 SEQ ID No. 36、 SEQIDNo. 37、 SEQIDNo. 39、 SEQIDNo. 41、 SEQIDNo. 43、或SEQ ID No. 45所示 氨基酸序列，只是在第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多 个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述组是通过结构对比所述 亲本序列与本文限定的P10480结构模型而鉴定的，优选是通过如本文所讲 授的结构对比P 10480晶体结构坐标与1IVN.PDB和/或1DEO.PDB而获得的。依照还有一个方面，本专利技术提供了一种糖脂酰基转移酶变体，其中酶变体包含SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 6、 SEQIDNo. 12、 SEQIDNo. 14、 SEQIDNo. 16、 SEQIDNo, 18、 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磷脂转移酶活性升高的脂酰基转移酶变体，其包含氨基酸序列基序ＧＤＳＸ，其中Ｘ是下列氨基酸残基中的一种或多种：Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、或Ｓ，其中所述酶变体相对于亲本序列在下列任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改：　Ｓ３Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐ或Ｍ；　Ｄ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ、Ｋ或Ｃ：　Ｓ３１０Ｔ；　３１８Ｅ；　Ｅ３０９Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ或Ａ；　Ｙ１７９Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ或Ｓ；　Ｎ２ １５Ｓ、Ｌ、Ｒ或Ｙ；　Ｋ２２Ｅ、Ｒ、Ｃ或Ａ；　Ｑ２８９Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ或Ｎ；　Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ或Ｓ；　Ｈ１８０Ｑ、Ｒ或Ｋ；　Ｍ２０９Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ或Ｌ；　Ｌ２１０Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ 、Ｉ、Ｗ或Ｍ；　Ｒ２１１Ｔ；　Ｐ８１Ｇ；　Ｖ１１２Ｃ；　Ｎ８０Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ或Ｇ；　Ｌ８２Ｎ、Ｓ或Ｅ；　Ｎ８８Ｃ；　Ｎ８７Ｍ或Ｇ；　其中上列残基是通过变体序列与ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ．２序列的比对而获得。...

【技术特征摘要】
GB 2003-12-24 03300167;WO 2004-1-15 PCT/IB2004/0001.一种磷脂转移酶活性升高的脂酰基转移酶变体，其包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，其中所述酶变体相对于亲本序列在下列任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改S3N、E、K、R、A、P或M；D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K或CS310T；318E；E309R、E、L、R或A；Y179D、T、E、R、N、V、K、Q或S；N215S、L、R或Y；K22E、R、C或A；Q289R、E、G、P或N；M23K、Q、L、G、T或S；H180Q、R或K；M209Q、S、R、A、N、Y、E、V或L；L210R、A、V、S、T、I、W或M；R211T；P81G；V112C；N80R、G、N、D、P、T、E、V、A或G；L82N、S或E；N88C；N87M或...

【专利技术属性】
技术研发人员：安加H凯利特史密斯，赖克H洛伦岑，乔恩B索伊，乔恩D米克尔森，阿诺德克赖杰，
申请(专利权)人：丹尼斯科公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]