【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因，具体涉及一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法。
技术介绍
1、植物遗传转化是植物基因工程和先进分子育种的重要工具。然而，目前植物遗传转化通常通过两种方式之一进入植物细胞：其一是农杆菌介导遗传转化，其二是基因枪法。但这些转化方法除了需要依赖繁琐的组织培养操作过程外，还严重依赖于植物种类和基因型，转化效率低，不确定性大。此外，大多数植物物种不易进行遗传转化，这对基因工程技术的实际应用带来了巨大的挑战。
2、在全球范围内，针叶树是木材和纸浆材的重要来源，具有巨大的经济和生态价值。针叶树基因组庞大、杂合性高、营养生长期长、遗传转化体系有限，限制了研究其发育调控的研究的开展，导致研究进展缓慢。
3、油松（ pinus tabuliformis）是针叶树研究的代表性物种。油松是我国特有的乡土针叶树种，又称为“中国松（chinese pine）”，生态适生区达300万平方公里，是我国重要的生态与用材树种。同时，油松25gb超大基因组高质量组装与精确基因注释也已经完成，是世界上质量最高的针叶树基因组之一（niu, et al.，2022）。因此，油松是研究针叶树遗传转化理想的模式树种材料。
4、但是，油松的遗传转化体系一直难以突破，导致涉及油松基因功能鉴定与基因工程育种等研究难以展开，进展十分缓慢。遗传转化难题已经成为针叶树基础研究领域最严峻的技术瓶颈。因此，开发了一种高效本体遗传转化及功能鉴定体系对于其关键功能基因的研究是十分
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种省时、操作简便的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法。
2、本专利技术采用如下技术方案：
3、一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其包括如下步骤：
4、（1）将含有 ruby报告基因和目标基因的载体转化到发根根瘤菌中，得到含有ruby报告基因和目标基因的发根根瘤菌菌体；
5、（2）将油松种子种在湿润且蓬松的水苔上，培养得到幼苗；
6、（3）当植物外植体的茎长距根部超过3cm时，切掉所述植物根部，将植物伤口处浸没在发根根瘤菌重悬液中，对植物进行抽真空，真空压力值为0.05~0.08 mpa，时长为5~60min。将所述植物外植体从重悬液中取出，将所述植物根部伤口处裹满含有 ruby报告基因和目标基因的发根根瘤菌菌体，然后移栽至土培基质中；
7、（4）培养30~45d，当愈伤组织分化为再生不定根时，观察再生阳根的颜色，判断是否为植物阳性转化根，阳性根为粉红色。
8、进一步的，所述目标基因可为任何目的基因或者为空。
9、优选的，所述含有 ruby报告基因和目标基因的载体为p35s:ruby。
10、进一步的，所述发根根瘤菌为k599。
11、进一步的，步骤（1）具体包括如下步骤：
12、（a）将含有 ruby报告基因和目标基因的载体用化学转化法转化发根根瘤菌k599感受态细胞中；
13、（b）将转化后的发根根瘤菌接入抗性ty培养基中，28℃震荡培养12~16h，得到发根根瘤菌菌液；
14、（c）将发根根瘤菌的菌液进行7000~8000 rpm离心收菌，使菌体附着在离心管壁上，并用抗性ty培养基进行重悬，涂布于抗性ty固体培养基平板上，平板放置于28℃培养箱倒置培养2~3d，直到在固体培养基表面长出菌层。
15、进一步的，每升抗性ty培养基含有75~100mg壮观霉素、5g蛋白胨、3g酵母提取物和1m氯化钙。
16、优选的，每升抗性ty培养基含有75 mg壮观霉素、5g蛋白胨、3g酵母提取物和1m氯化钙。
17、进一步的，所述抗性ty固体培养基为每升抗性ty培养基中添加15 g琼脂粉。
18、进一步的，步骤（3）中，切根的位置为植物的根茎结合处以上0.5~1cm处。
19、优选的，刀片倾斜45°切掉植物根茎结合处以上0.5cm处。
20、进一步的，步骤（3）中，所述重悬液配方为10mm 2-吗啉乙磺酸、10mm 氯化镁（koh-ph=5.6）、乙酰丁香酮150μm。
21、进一步的，步骤（3）中，发根根瘤菌重悬液的制备方法为，将步骤（b）获得的发根根瘤菌菌液在室温下进行7000 rpm离心10min收菌，使菌体附着在离心管壁上，并用上述的重悬液进行等体积重悬2次，使重悬液od600在0.8~1.2之间。
22、优选的，重悬液od600为1.2。
23、进一步的，步骤（3）中，土培基质为粗蛭石土壤介质，粗蛭石的粒径为5~8mm。
24、进一步的，步骤（3）中，移栽后的培养条件为：生长温度为19~24℃，湿度为65%~75%；生长期间的光照强度为150μmol·m-2·s-1。
25、进一步的，步骤（4）中，再生不定根的颜色为鲜艳的粉红色，是甜菜红素累积的现象，可以判断为植物阳性转化根。
26、本专利技术的有益效果在于：
27、本专利技术提供了一种在非组织培养条件下，发根根瘤菌介导的阳性转化根的构建方法，与常规植物转基因体系相比，本专利技术所述方法可绕开组织培养等一系列复杂的操作，省时、操作简便。
28、由于针叶树种与被子植物存在显著差异，针叶树种基因组巨大、基因结构复杂、富含重复序列与超长内含子，遗传转化十分困难，使得目前可供借鉴的高效针叶树的遗传转化相关报道少之又少。目前国际上最成功的体细胞胚胎发生介导的遗传转化技术难度极大，且至少需要6个月以上才可获得转化植株。本专利技术突破性的在非组织培养的条件下利用发根根瘤菌介导的植物转基因技术，在30~45d内即可诱导出阳性转化不定根，对油松以及针叶树种不定根遗传转化研究做出了巨大贡献，可以给予相关研究针叶树领域人员一些启示与参考。
29、本专利技术遗传转化技术可结合crispr-cas9、rnai和超量表达等技术在植物的根中有效地开展基因功能的研究，同时也为进一步通过转基因根诱导愈伤组织，最终为获得转基因植株奠定技术与理论基础。
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1.一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，每升抗性TY培养基含有75~100mg壮观霉素、5g蛋白胨、3g酵母提取物和1M氯化钙。
4.根据权利要求2所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，所述发根根瘤菌为K599。
5.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，切根的位置为植物的根茎结合处以上0.5~1cm处。
6.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，重悬液配方为10mM 2-吗啉乙磺酸、10mM 氯化镁 （KOH-PH=5.6）、乙酰丁香酮150μM；将发根根瘤菌菌液进行7000~8000 rpm离心收菌，使菌体附着在离心管壁上，并用重悬液进行等体积重悬2次，最终使菌液浓度OD600在0.8~1.2之间，得
7.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，抽真空时的真空压力值为0.05~0.08 MPa，时长为5~60min。
8.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，土培基质为粗蛭石土壤介质，粗蛭石的粒径为5~8mm。
9.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，移栽后的培养条件为：生长温度为19~24℃，湿度为65%~75%；生长期间的光照强度为150 μmol·m-2 ·s-1。
...【技术特征摘要】
1.一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，每升抗性ty培养基含有75~100mg壮观霉素、5g蛋白胨、3g酵母提取物和1m氯化钙。
4.根据权利要求2所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，所述发根根瘤菌为k599。
5.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，切根的位置为植物的根茎结合处以上0.5~1cm处。
6.根据权利要求1所述的发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，重悬液配方为10mm 2-吗啉乙磺酸、10mm 氯化镁...
【专利技术属性】
技术研发人员：钮世辉，李京京，孟冬，李晨赫，左权，宋依桐，高凯，刘佳凡，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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