【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及融合酶领域，具体涉及利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白的方法。
技术介绍
1、随着人类的快速发展，化石燃料的规模开采导致了化石燃料紧缺，环境污染等问题，阻碍了社会的可持续发展。生物质能源是一种清洁可再生的能源，具有储量丰富、价格低、减轻环境污染以及减缓化石燃料紧缺带来的问题，并且具有替代传统化石能源的巨大潜力，实现可持续发展战略。
2、木质纤维素是地球上最丰富的生物质资源，其主要由纤维素(占干物质重的30-50％)、半纤维素(占干物质重的20-40％)及木质素(占干物质重的15-25％)三部分构成，此外还包括少量的结构蛋白、脂类和灰分。其中半纤维素是由不同类型的单糖(包括五碳糖和六碳糖)构成的，因此木质纤维素材料水解后可释放大量单糖，除了葡萄糖外，还有含量可观的木糖等戊糖。因此实现木糖的高效利用可以推动木质纤维素材料水解液全糖组份的充分利用，为以木质纤维素为原料生产乙醇在实际生活中经济可行奠定基础。它作为地球上最丰富的有机高分子，不仅构成了植物细胞壁的主要成分，也是生态系统中重要的碳库。这种天然的、可再生的资源因其独特的化学和物理性质，已成为生物能源研究领域的热点。
3、酵母菌作为工业产品生产的具有潜力的宿主已被广泛用于商业。已知有1500多种酵母，但其中只有极少数被用作生产重组蛋白的宿主生物。最广泛用于重组膜蛋白生产的两种是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。已知酿酒酵母(saccharomyces
4、其中,木糖转运环节被认为是现阶段酿酒酵母代谢工程木糖利用的主要限速步骤之一。野生型酿酒酵母虽然不能代谢木糖,但可以依赖于自身非特异性的己糖转运蛋白来摄取木糖。研究发现，内源主要的木糖转运蛋白为hxt1p、hxt2p、hxt4p、hxtsp、hxt7p和gal2p，其中，gal2p和hxt7p的木糖转运效率最高，但这些转运蛋白对木糖的亲和力低于葡萄糖。受到葡萄糖的强烈抑制，限制了木糖的利用。获得一个转运木糖效率高且不受葡萄糖抑制的木糖转运蛋白是提高木糖转运效率以及木糖的利用效率的有效策略。
5、在酿酒酵母中异源表达木糖高亲和力的转运蛋白或提高现有木糖转运蛋白的亲和力有利于提高木糖的摄取效率，提高木糖的整体代谢能力。虽然已经报道一些功能性相对于内源转运蛋白较好的异源木糖转运蛋白，但一般都受葡萄糖的抑制，特异性不强，效率不高，也有一些通过定点突变之后克服葡萄糖的抑制，只转运木糖的木糖转运蛋白，转运效率有提升，但转运效率相对于葡萄糖转运效率并不高，仍需要继续研究，可以转换思维，通过祖先序列重建的方式来获得功能性更好的木糖转运蛋白。
6、祖先序列重建(asr)是一种新兴的半周期蛋白质工程设计策略，它可以识别整个蛋白质中稳定但中性的突变。asr产生的酶显示出更好的稳定性、底物范围或两者都提高。与其他蛋白质工程方法不同，asr使用比对序列和mrbayes树作为输入，通过精确的系统发育分析开发的计算方法来推断祖先序列。推断出的祖先通常与现有的序列有不同，这可能会产生有益的突变，而其他蛋白质工程无法获得这些突变，包括协调的突变集与传统方法相比，asr具有以下优点，突变的随机性足够大；筛选范围较小；目标酶的详细结构信息在重建过程中并不是必需的。然而，据我所知，目前还没有关于asr应用于木糖转运蛋白的报道。
7、构建高效利用木糖的酿酒酵母工程菌株，可以有效提高酿酒酵母的木糖利用能力，提高利用效率，节约成本，是纤维素乙醇规模化生产与应用的前提条件之一。转运环节是酿酒酵母对木糖利用的第一步，受到葡萄糖的强烈抑制，是制约木糖利用的瓶颈问题之一。目前虽然有已经报道的木糖转运蛋白，但是高效转运木糖的较少，不足以支持广泛应用，因此开发高效转运木糖的转运蛋白仍是一大研究热点。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白构建方法和应用。
2、本专利技术的方案具体内容如下：
3、利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白的方法，包括以下步骤：
4、步骤1、氨基酸序列的收集：选择gxf1和sut1作为目标蛋白，构建一个包括多个同源蛋白质序列的数据集；
5、步骤2、多序列比对：在数据集中去除和目标氨基酸序列长度差异显著的同源序列，并除去冗余的序列，获得多个同源氨基酸序列，对除去冗余后的多个序列进行多序列比对分析，比对结果进行可视化分析，分析同源序列的保守性序列，剔除影响比对整齐性的序列以及手动校正序列中非保守区域的整齐性，提高间隙处的可靠性，再次使用mafft重新比对，得到多序列对比文件；
6、步骤3、模型评估：将最终生成的多序列比对文件利用prottest得到氨基酸最优取代模型lg+i+g；
7、步骤4、构建系统发育树：依据lg+i+g氨基酸取代模型对多序列对比文件运行多次引导的最大似然构建系统发育树，由在线工具对构建的系统发育树进行可视化输出；
8、步骤5、根据lg模型对输入的系统发育树和多序列比对文件进行祖先序列重建，得到祖先节点的蛋白质序列后除去冗余序列得到祖先序列重建数据；
9、对祖先序列重建数据进行可视化分析得到祖先序列树枝图，通过分析祖先节点和ncbi现有数据库的相似性，筛除祖先序列树枝图上相似度大于95％的祖先节点，从剩余的祖先节点中选取n3号节点，并命名为祖先节点xt7，对于祖先节点xt7通过paml软件的fastcodeml模块进行重建得到对应的氨基酸序列，如seq id no：1所示；
10、步骤6、利用祖先节点xt7的氨基酸序列得到木糖转运蛋白xt7的基因，对木糖转运蛋白xt7的基因进行表达得到木糖转运蛋白xt7。进一步的，所述步骤1具体为：
11、选择中间假丝酵母的gxf1和树干毕赤酵母的sut1作为目标蛋白，在美国国家生物技术中心中，通过blast以目标蛋白质作为查询序列检索同源氨基酸序列，并下载identity大于30％以及coverage大于70％的同源氨基酸序列，构建一个包括多个同源蛋白质序列的数据集。
12、进一步的，所述步骤2具体为：
13、在数据集中去除和目标氨基酸序列长度差异显著的同源序列，并除去通过使用cd-hit消除高度相似的序列，获得多个同源氨基酸序列，使用mafft对除去冗余后的多个序列进行多序列比对分析，比对结果利用mega进行可视化分析，分析同源序列的保守性序列，剔除影响比对整齐性的序列以及手动校正序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因Xt7及其蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因Xt7及其蛋白的方法，所述步骤1具体为：
3.根据权利要求1所述的利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因Xt7及其蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
4.根据权利要求1所述的利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因Xt7及其蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中，通过输入系统发育树和多序列比对文件在PAML软件中使用FastCodeML程序根据LG模型进行祖先序列重建，得到祖先节点的蛋白质序列后除去冗余序列，得到祖先序列重建数据。
5.利用祖先序列重建获得的木糖转运蛋白Xt7，其特征在于，蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1，蛋白基因的碱基序列如SEQ ID NO：2。
6.权利要求5所述的木糖转运蛋白Xt7在提高重组酿酒酵母的木糖转运效率中的应用。
【技术特征摘要】
1.利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白的方法，所述步骤1具体为：
3.根据权利要求1所述的利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
4.根据权利要求1所述的利用祖先序列重建获得木糖转运蛋白基因xt7及其蛋白的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李华南，张佩宁，江正兵，刘家书，程万里，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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