本发明专利技术提供了一种与人类早期肺癌组织及癌前病变组织中ＨｎＲＮＰ Ｂ１抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体的制备方法，它是经用人工合成１８肽与血蓝蛋白偶联作为抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，再用其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，再筛选与功能测定筛选出所需杂交瘤细胞株，此杂交瘤细胞可用体内或体外的方法大量制备抗ＨｎＲＮＰ Ｂ１单克隆抗体，经饱和硫酸铵沉淀法、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析将ＨｎＲＮＰ Ｂ１单抗纯化。本发明专利技术还提供了该抗体在人类早期肺癌检测的试剂盒中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫
，具体涉及一种单克隆抗体的制备，利用该方法制备的单克隆 抗体对早期肺癌组织及癌前病变组织细胞中特异性表达的蛋白一不均一核糖核蛋白Bl (HnRNPBl)抗原有特异反应活性。
技术介绍
目前在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。平均每30秒就有一人死于肺癌，在 10个确诊为肺癌的患者中，仅有一人能够生存超过5年。世界卫生组织(WHO)2000年报告 1997年全世界死于恶性肿瘤的共706.5万人，占死亡人数的12.6%，其中肺癌占恶性肿瘤死 亡的19%,居恶性肿瘤死因的第 一位。目前在多数发达国家中，肺癌居男性恶性肿瘤首位， 在女性占第二位。据美国癌症协会(ACS)估计，在2002年美国肺癌死亡占癌症死亡总数的 27°/。 28%。在我国肺癌已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，发病率和死亡率-'直呈明 显上升趋势。20世纪90年代与70年代相比，我国肺癌的死亡率上升了 111.85%。到本世纪 初，肺癌的死亡率已由20世纪70年代位居癌症死因的第4位攀升为第1位。由于已暴露的 人群数目甚大，上升趋势至少要延续20 30年。英国著名肿瘤学家R.Peto预言如果我国 不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100万，成为世界第一肺癌大国。 肺癌是人类致死的重要因素，其发病率有逐年增多的趋势。因此，应在防治方面谋对策。然 而在过去30年中，肺癌患者的生存率无明显改善，其根本原因之一是肺癌的早期诊断率低。 目前肺癌尚无特效的治疗方法，早期发现、早期诊断早期^疗是提高生存率的关键。肺 癌痰脱落细胞学检査是目前临床对肺癌诊断常用的方法之一。但随着肺癌患者的增加，经研 究发现，痰脱落细胞学检查未能够降低死亡率，人类生命受到了严重的威胁。Tockman等 (Tockman M S ， Gupta P K,Myers J D ， " a/ . Sensitive and specific monoclonal antibody recognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cells : a new approach to early lung cancer detection. J Clin Oncol ，1988 ，6 (11) :1685 — 1693)报告了—-种敏感的早期肺癌检测的方 法，即采用抗不均一核糖核蛋白A2 /Bl (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HnRNP A2 /Bl)单克隆抗体免疫染色痰脱落细胞。在临床前2年肺癌患者痰中即可检测到HnRNP A2/B1 , 其敏感性与特异性分别为91°/。及88% ，明显优于痰脱落细胞学检查。Sueoka等(Sueoka E,Goto Y, Sueoka N,ef 'heterogeneous nuclear ribonucleoprein Bl as new marker of early detection for human lung cancers.Cencer Res,1999，59:1404-1407)分别制备了抗HnRNP A2的抗体和抗 HnRNPBl的抗体，证明了在肺癌细胞HnRNPBl显著增加，而HnRNP A2没有增加，HnRNP3A2/B1的增加主要是HnRNP Bl增加所致，所以HnRNP Bl比HnRNP A2/B1更特异。说明 HnRNPBl作为肺癌诊断的分子标志物具有重要意义。HnRNP( heterogeneous nuclear ribonudeoprotein ,hnRNP)是存在于细聰核中的--种RNA 结合蛋白，它包括近30种与核酸结合的蛋白质，且它们之间相互作用形成复合体，分子量在 34 120KD之间。HnRNP的A2、 Bl是其核心蛋白中两种主要的蛋白质。HnRNPBl基因的 cDNA序列在第二个外显子上比HnRNP A2多一个长36bp的片段，其表达的氨基酸序列也比 后者多一个12个氨基酸的片段。HnRNP BlmRNA仅占HnRNP A2/BlmRNA组成的2% 5%( Kozu T ， Henrich B , Schafer K P. Structure and expression of the gene (HNRPA2B1 ) encoding the Human hnRNP protein A2/ Bl .Genomics ,1995 ,25(2) :365-371)。HnRNP A2/B1被发现在正常肺生长的关键阶段过度表达，在肺癌发生早期或 癌前阶段，HnRNP A2/B1广泛表达于恶性病变和增殖细胞中。有研究表明(Montuenga LM， Zhou J, Avis I，ef a/. Expression of heterogeneous nuclear ribonudeoprotein A2/B1 changes with critical stages of mammalian lung development. Am J Respir Cell Mol Biol,1998,19:554-562), HnRNP A2 /Bl mRNA和蛋白的表达程度与小鼠肺的发育成熟程度--致。胚肺中的HnRNP A2/B1蛋白随胚肺发育开始表达,最早可在肺发育早期的假腺期被检测到，在假腺期末期和小 管期的起始期达到高峰，在囊(小泡)期仍'维持高水平的表达。随着肺组织的发育，远端初级肺 的柱状上皮细胞显示较高HnRNP A2/B1的表达，然而在近端的气道及成熟肺组织未发现 HnRNPA2/B1表达。而在肺组织发育成熟后，HnRNP A2/B1在肺组织中表达受限。HnRNP A2/B1在癌中表达形式类似于在胚肺中的调控表达，这种形式在蛋白质水平和信号分子水平 是一致的，提示HnRNP A2/B1可能是一种癌生长蛋白。HnRNP A2/B1与细胞核内RNA拼接、mRNA的转运及转录后调节，特别是与RNA转录、 外显子剪切位点的选择，Pre—mRNA的成熟和降解等密切相关。HnRNP A2/B1在胞核与胞浆 之间的穿梭可被RNA聚合酶II抑制剂激活，并参与了将mRNA从胞核向胞浆中转移和对转录 过程的调控，是细胞增生过程中不可缺少的重要内素(常珍,沈佐君,操乐杰.异质性胞核核糖核 蛋白A2/B1与肺癌的早期诊断.临床检验杂志，2004,22(6):476-478)。他RNP具有明显的RNA结合特异性，主要由其分子中的RNA结合结构域所决定。HnRNP 可以"底物呈递"的方式参与RNA的加工过程，并且HnRNP与RNA形成的复合体呈动态变化。 HnRNP结合到Pre-mRNA的特定部位引起其二级结构的改变，从而有利于一些加工因子结合 到Pre-mRNA上。另外HnRNP决定mRNA的不同拼接方式，从而基因的表达产物也就不同。 HnRNP A2/Bl在Pre-mRNA的加工过程中表达异常可能导致一些在细胞增殖或分化过程中的 重要调节蛋白质翻译错误，从而导致细胞癌变。此外HnRNP还可参与多蛋白的聚集作用，并在核-质转移中也起一定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗ＨｎＲＮＰ Ｂ１抗原的单克隆抗体的制备及其应用，是与人类早期肺癌组织及癌前病变组织中ＨｎＲＮＰ Ｂ１抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体的制备方法及其应用。其特征是：用人工合成１８肽与血蓝蛋白偶联作为抗原免疫小鼠，再用其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。再筛选与功能测定筛选出所需杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞可用体内或体外的方法大量制备抗ＨｎＲＮＰ Ｂ１单克隆抗体，经饱和硫酸铵沉淀法、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析将抗ＨｎＲＮＰ Ｂ１单抗纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：欧平，李为民，魏大鹏，
申请(专利权)人：欧平，李为民，魏大鹏，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]
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