稳定表达细胞周期因子ＦｏｘＭ１的体系及其医药用途制造技术

本发明专利技术关于稳定表达细胞周期因子ＦｏｘＭ１的体系及其医药用途。本发明专利技术公开了一种细胞周期因子ＦｏｘＭ１基因或蛋白的用途，用于制备增强肝细胞增殖的组合物或体系。本发明专利技术还公开了一种含有细胞周期因子ＦｏｘＭ１基因的重组表达载体。本发明专利技术还公开了一种可表达细胞周期因子ＦｏｘＭ１蛋白的细胞以及含有所述细胞的组合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及稳定表达细胞周期因子 FoxMl的体系及其医药用途。
技术介绍
肝移植是目前终末期肝脏疾病唯一有效的治疗方式，但供肝来源的缺乏使 其临床应用受到很大的限制。近二十年来，作为原位肝移植的替代方案，临床 上一直致力于开展肝细胞移植技术的研究，并取得了一定的疗效。然而，由于 移植的肝细胞在宿主肝脏内增殖缓慢，治疗性肝脏再殖仍难以实现，成为阻碍 目前肝细胞移植技术发展的瓶颈问题。肝脏再殖(Liver Repopulation)，指肝细胞在受体肝脏中的有意义植入的现 象，即肝细胞及其所增殖的子代细胞能够稳定地参与肝板的结构组成，并能正 常地发挥肝细胞的生理功能。研究表明，供体细胞在受体肝脏内有效增殖的前 提是必须赋予供体细胞比内源肝细胞更强的生长或生存优势。目前的研究表 明，通过增强供体肝细胞的增殖能力获得"超级肝细胞"是实现肝脏再殖的有效 策略。然而，要找到一种既能够显著增强供体肝细胞的增殖能力，又没有潜在 的毒副作用的方法非常困难。因此，本领域迫切需要研究增强肝细胞增殖能力且对于哺乳动物(如人)没 有潜在的毒副作用的产品和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞周期因子FoxMl基因或蛋白的用途，用 于制备增强肝细胞增殖的体系。本专利技术的目的还在于提供一种含有细胞周期因子FoxMl基因的非病毒重 组表达载体及其用途。本专利技术的目的还在于提供一种可过表达细胞周期因子FoxMl蛋白的细胞 以及含有所述细胞的组合物。4在本专利技术的第一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括以下可操 作性相连的元件(a) 细胞周期因子FoxMl基因表达系统，该系统从5'到3'依次包括元件 Caggs启动子、细胞周期因子FoxMl基因、终止子；和(b) SB转座酶基因表达系统。在另一优选例中，所述的表达载体是一种非病毒载体。在另一优选例中，所述的表达载体含有CMV增强子或其片段、鸡P-actin 启动子或其片段、e-球蛋白内含子或其片段；较佳的所述的表达载体由CMV 增强子或其片段、鸡e-actin启动子或其片段、P-球蛋白内含子或其片段融合 而成。在另一优选例中，在(b)中，所述的SB转座酶基因表达系统从5'到3' 依次包括元件PGK启动子、SB转座酶基因、终止子。在另一优选例中，在(a)中，在细胞周期因子FoxMl基因与终止子之间， 还依次含有内部核糖体进入位点(IRES)序列、报告基因。在另一优选例中，所述的报告基因是Ds-Red。在另一优选例中，所述的各元件之间具有0-1000bp(较佳的0-500bp)的间隔序列。在另一优选例中，所述的表达载体的骨架载体是pKT2-CMV-FAHIL-SB载体。在另一优选例中，所述的表达载体应用了改造的"睡美人"(Sleeping Beauty, SB)转座子系统。在本专利技术的第二方面，提供一种重组的细胞，所述的细胞含有所述的表达 载体；或者所述的细胞基因组中整合有以下可操作性相连的元件Caggs启动 子、细胞周期因子FoxMl基因、终止子。在另一优选例中，所述的细胞是肝细胞、胚胎干细胞或胚胎干细胞肝向分 化的细胞。在本专利技术的第三方面，提供一种制备所述的重组细胞的方法，所述方法包括-(1) 将本专利技术所述的表达载体转染细胞；(2) 分离含有所述的表达载体的细胞或基因组中整合有以下可操作性相连的元件Caggs启动子、细胞周期因子FoxMl基因、终止子的细胞，即为所述 的重组细胞。在本专利技术的第四方面，提供所述的细胞的用途，用于制备促进肝脏再殖的 组合物。在本专利技术的第五方面，提供一种增强肝脏再殖的组合物，所述的组合物含有(1) 有效量的所述的细胞；和(2) 与所述细胞相容性的药学载体。在本专利技术的第六方面，提供一种细胞周期因子FoxMl基因或蛋白的用途， 用于制备增强肝脏再殖的体系。在另一优选例中，所述的体系是含有所述细胞周期因子FoxMl基因的表 达载体，或过表达所述细胞周期因子FoxMl的宿主细胞。在本专利技术的第七方面，提供一种促进肝脏再殖的方法，包括将所述的细胞 递送到需要肝脏再殖的部位。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图l显示了在SB载体中选择各种启动子，其驱动报告基因荧光素酶基因表 达水平的差异。通过检测宿主肝脏中不同启动子启动的荧光素基因表达水平的 差异，对多个启动子(包括Caggs、 CMV、 UbC和PGK)进行了比较。将各个启 动子驱动的荧光素基因构建到SB载体中，通过流体力学尾静脉法将载体注射到 小鼠肝脏，以活体体内光学成像技术检测荧光素表达水平。结果表明Caggs启 动子是其中表达水平最高的。图2显示了以pKT2-CMV-FAHIL-SB载体(A)为基础，构建红色荧光蛋白 基因标记的FoxMl基因SB载体。从pIRES2-dsREd2-Express vector (Clontech)上 扩增IRES-dsRed2 ， 通过EcoRI/Sa11 取代FAHIL ， 得到 pKT2-CMV-IRES-dsRed2-SB (B);将FoxMl cDNA通过EcoRI/Xho1连接至 pKT2-CMV-IRES-dsRed2-SB，得至UpKT2匿CMV-mFoxMl-IRES-dsRed2-SB (C); 最后，通过Pmel/EcoRI将CMV启动子替换成Caggs启动子，得到 pKT2-Caggs-mFoxMl-IRES誦dsRed2-SB (D)。图3显示了在肝脏再殖模型Fah基因剔除小鼠(Fah^')中，稳定表达FoxMl 的肝细胞(Ds-Red阳性肝细胞)的肝脏再殖情况。移植3周后，用抗FAH蛋白的 免疫组化染色试剂检测再殖情况，形成的肝细胞具有正常的形态。图4显示了在Rag-2"Fah;小鼠的肝脏中，稳定表达FoxMl的肝细胞和 Rosa-26 e-gal肝细胞增殖情况的比较。在移植稳定表达FoxMl的肝细胞5周 后，即已完成肝脏的完全再殖；而移植Rosa-26 P-gal肝细胞7周后，才完成肝脏的完全再殖。图5显示了在竞争性肝脏再殖过程中，直接比较稳定表达FoxMl的肝细 胞和Rosa-26肝细胞的增殖情况。数目相等(1X1()S个)的稳定表达FoxMl的肝 细胞和Rosa-26肝细胞混合并移植到Rag-2"7Fah—'—小鼠(A)和2/3肝切野生型小 鼠的肝脏中，在两种受体中，稳定表达FoxMl的肝细胞都比Rosa-26肝细胞呈 现更高的再殖效率。图6显示了通过转染荧光素酶标记FoxMl基因的SB载体，体外荧光成像 技术对整合FoxMl基因的肝细胞的增殖能力进行分析。 A:荧光素酶基因标记的FoxMl基因SB载体示意图。 B:体外荧光成像技术检测到整合FoxMl基因的肝细胞具有更强的增殖能力。具体实施例方式本专利技术人经过广泛的研究，发现在肝细胞内过表达细胞周期因子FoxMl 可显著地增强肝细胞的增殖能力。本专利技术人还建立了含有FoxMl基因的非病毒 载体修饰供体肝细胞的技术体系，从而为临床应用奠定了基础。通过将本专利技术 人构建的非病毒载体体外转染供体肝细胞，可获得稳定表达FoxMl的细胞，所 述细胞在被递送到肝脏后，增殖能力非常强，并且没有造成肝脏的形态学异常 或癌变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括以下可操作性相连的元件：　　　　（ａ）细胞周期因子ＦｏｘＭ１基因表达系统，该系统从５’到３’依次包括元件：Ｃａｇｇｓ启动子，细胞周期因子ＦｏｘＭ１基因，和终止子；和　　　　（ｂ）ＳＢ转座酶基因表达系统。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王欣，何志颖，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]