一种甜瓜杂交种的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及植物品种的鉴定方法，具体公开了一种甜瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　Ｌ．）杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物ＧＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴ和ＧＧＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＴＡ对样本的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。该方法的优点是速度快、周期短、不受环境条件影响、结果稳定准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物品种的鉴定方法，具体涉及利用分子标记(SCAR-Sequence Characterized Amplified Regions)技术鉴定甜瓜(L )杂交种的纯度及真实性 的方法。
技术介绍
甜瓜(Cwcmm's weto L.)是我国重要的经济作物之一。随着甜瓜产业的迅速发展，目 前甜瓜杂交一代品种已广泛应用于生产，但是在人工杂交制种过程中，由于隔离不严或人 工去雄不及时、不彻底等原因，常混有母本自交系种子或由其它不明来源甜瓜花粉所造成 种子的生物性混杂；同时在种子流通过程中，也可能会出现外来种子混入或人为掺假造成 的机械混杂，不仅给生产带来了重大损失，也制约了甜瓜杂交种的推广应用。此外，个别 不法分子为牟取暴利，甚至盗用育种者的亲本材料繁种销售，大大侵害了育种单位和育种 者的合法知识产权。因此，寻找一种快速有效地鉴定甜瓜杂交品种/组合真实性和纯度的方 法十分必要。传统的大田形态鉴定法仍是目前最常用的方法。该法鉴定结果虽较为可靠，但周期长， 花费大，占用土地，受季节限制，秋季鉴定往往要利用温室或到海南等气候适宜的地方进 行，而且很多性状的表现易受栽培措施及环境因子的影响；鉴定者的观察经验也制约着鉴 定的准确性；随着大量新品种的不断涌现，又增加了形态鉴定的难度。因此该法不能有效 地起到"打假"的作用。九十年代，我国不少学者曾利用蛋白质、同工酶电泳技术对甜瓜杂交种迸行鉴定。该 法可在室内进行，易于早期识别。但是同工酶和蛋白质都是基因表达的产物，都是对基因 的间接反应，多态位点有限，且易受发育阶段和表达器官的影响，条件要求严格，不易控 制。再者，它们的提取过程复杂，尤其是同工酶，需要低温操作，耗时长，成分数量不稳 定，难以提取，不易对大量样本进行分析。随着分子生物学的飞速发展，各种DNA分子标记技术也相应问世。美国科学家Williams 等建立的RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)技术是发展较早的分子标记技术之 一，由于该技术具有操作简便，速度快，费用低等优点，特别是它可以对无任何分子生物学基础的物种展开研究，因此倍受青睐。闫鹏等从100条RAPD引物中筛选到在2个甜瓜 杂种一代及其亲本间呈现多态性的特异引物，可用于其纯度鉴定(《甘肃农业大学学报》， 2007, 42 (2)， 43~46)。乐锦华等利用20个随机引物对厚皮甜瓜8个亲本与4个杂交种进 行RAPD分析，发现10个引物的扩增谱带具有多态性，亲本具有各自的特异谱带，绝大部 分Fi的谱带是双亲互补带，可用于亲缘关系及纯度的鉴定(《果树科学》，2000， 17 (4)， 295 299)。刘富中等(2002)从80个随机引物中选出5个可鉴定3个甜瓜杂交种的纯度， 其中0PM17可同时用于3个甜瓜杂种的纯度鉴定(《中国蔬菜》，2002 (5)， 7~9)。由于 RAPD技术稳定性、重复性较差，鉴定结果的准确度会大受影响。再者，利用分子标记技 术鉴定甜瓜杂交种的真伪目前还处于空白阶段。
技术实现思路
本专利技术使用了 RAPD-SCAR分子标记及相关分子生物学技术，目的旨在建立一套快速、 准确地鉴定甜瓜杂交种纯度及真伪的新方法。本专利技术公开了一种甜瓜(CWCWwh we/o L.)杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物 GGGATATCGGAAGGT和GGGATATCGGGAATA对样本的基因组DNA进行PCR扩增。上述甜瓜(Cwc^^ we/o L.)杂交种为'东方蜜2号'。上述特异双引物为针对甜瓜 (Cwc謹z》舰/o L.)杂交种'东方蜜2号，的特异RAPD标记序列设计的。较佳的，上述 样本的基因组DNA为植物幼苗的基因组DNA。上述鉴定方法还包括根据PCR后439bp的DNA条带的有无对甜瓜(Cwwm》me/o L.) 杂交种的纯度及真实性进行鉴定。本专利技术的鉴定方法中，特异性引物通过下列方法筛选获得采用200条RAPD引物对 甜瓜(C"cww: me/o L.)杂交一代品种'东方蜜2号，及其亲本和7个同母异父的杂交组 合进行一系列的分子生物学技术处理和实验分析，并筛选到'东方蜜2号'的特异RAPD 标记，对RAPD标记迸行克隆和测序，根据测序结果设计并合成特异性PCR (Polymerase Chain Reaction)引物，并对该引物的特异性进行验证。最后利用该SCAR标记对甜瓜 (Cwcww&mWoL.)杂交种'东方蜜2号，进行真伪及纯度鉴定。筛选具体过程如下(1)材料DNA的提取以发芽3天的幼嫩子叶为材料，采用尿素提取法从甜瓜 (a/c謂^鹏/o L.)杂交种'东方蜜2号，及其亲本和同母异父的7个不同组合材料中提 取基因组DNA。4(2) RAPD多态性分析用200条10个碱基的寡核苷酸随机引物对各个材料的基因 组DNA进行RAPD多态性分析，从中筛选出扩增条带清晰、差异明显的RAPD标记。将 此标记回收纯化后在相同的反应条件下进行RAPD重扩增，从而得到增强的RAPD标记。(3) 克隆、测序将得到的增强RAPD标记回收纯化后克隆到载体上，进行测序，确 定多态性标记的DNA两端碱基组成。(4) SCAR特异引物的设计根据克隆片段两端的碱基序列设计出稳定性较强的特异 性双引物(PCR引物)。弓l物长度在14-25个碱基之间，原则上尽可能多的保留原RAPD引 物的碱基。(5) 甜瓜(a^W/mJme/0L.)杂交种纯度及真伪的SCAR检验应用开发出的特异双 弓I物对待鉴定对象进行纯度和真实性检验。本专利技术的甜瓜(Cwcww^we/oL.)杂交种的鉴定方法能快速准确地鉴定甜瓜(C"cww^ me/oL.)杂交品种/组合的真实性和纯度，技术稳定性、重复性好，鉴定结果的准确度高。附图说明图1和图2:为利用SCAR标记对甜瓜(CMCwmfsme/o L.)杂交种'东方蜜2号，真伪 鉴定的电泳结果l一50为50个不同的甜瓜(Cwcw脂;y微/o L.)品种/组合，其中11有明 显的特异SCAR标记，为事先混入的'东方蜜2号，。图3为利用SCAR标记对'东方蜜2号'杂交种纯度鉴定的电泳结果(显示部分样品 电泳结果)l是标准'东方蜜2号，种子，2—25是被检测的种子，其中13无SCAR标记 带，即不是'东方蜜2号'种子。具体实施例方式以下列举具体实施例进一步阐述本专利技术，应理解，具体实例并非用于限制本专利技术的保 护范围。实施例1 甜瓜(Cwcwm^ we/o L.)杂交种特异RAPD标记的筛选一、 种子发芽处理分别将甜瓜(Cwc纖/s靴/0 L.)杂交一代品种'东方蜜2号，及其父母本、与'东方 蜜2号'同母异父的7个不同杂交组合的种子浸种24小时，置于28"C条件下催芽24小时 后，播于湿润的蛭石中，20 28'C条件下培养3天，取其幼嫩子叶为材料进行DNA提取。二、 基因组DNA的提取称取子叶0.05克于1.5 ml离心管中，加入200 pl提取缓冲液(成分尿素7 M， Tris-HCl 0.2M(pH8.0)， EDTA0.05M，十二烷基肌氨酸钠2%),用小研棒迅速研磨成浆，再用400 ^提取缓冲液冲洗；加入600 nl酚-氯仿-异戊醇(25 : 24 : 1 )剧烈震荡20秒，12 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甜瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　Ｌ．）杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物ＧＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴ和ＧＧＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＴＡ对样本的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李菊芬，马国斌，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]