ＭＭＰ３基因中一个用于猪肉产品ＤＮＡ溯源的新ＳＮＰ分子标记制造技术

本发明专利技术公开了ＭＭＰ３基因中一个用于猪肉产品ＤＮＡ溯源的新ＳＮＰ分子标记，它是通过在６个猪品种或品系的试验群体（共计１９０个体）中，分析其ＭＭＰ３基因的ＳＮＰ位点等位基因的分布情况，通过克隆测序、序列分析比较而获得。所述ＭＭＰ３基因序列长５７３ｂｐ，其中包含完整的内含子２、内含子３和完整外显子２的序列，部分外显子１和部分外显子３的序列；其序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ？１所示，在其第１８２位碱基处有一个碱基突变１８２Ｃ－１８２Ｔ。通过在试验群体中等位基因的变异度分析，初步判定本发明专利技术的ＳＮＰ分子标记可用于猪肉产品溯源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属食品安全领域，具体涉及匪P3基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记。
技术介绍
鲜肉及肉制品是人们日常生活中必不可少的食品，受我国饮食习惯的影响，猪肉是人们日常生活中最主要的肉产品，因此猪肉产品的安全成为肉产品安全的重点。肉产品追溯系统作为一种食品质量安全风险控制管理手段，在越来越多的国家中得到应用，甚至一些国家以法规的形式明确规定不具备可追溯条件的肉产品禁止进入市场。通过肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径，更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，有助于社会的安定。 在我国的肉产品追溯体系中，主要使用的是标签溯源技术(物理方法)。如2004年，上海在规模化养猪厂建立了 "电子档案"；2005年福建省开通了肉产品质量查询系统；2008年，杭州建立了 "放心肉"的质量安全信息可追溯体系，同年北京市建立了畜禽产品追溯系统，纳入14家生猪屠宰企业和所有牛羊肉家禽生产加工企业，使用的是IC卡和电子标签(RFID)技术。 国外肉产品追溯系统采用的是DNA溯源技术(生物学方法)。DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异，每个个体的DNA指纹图谱是唯一而且不能改变的，于是可以把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的个体。相比之下，我国采用的标签溯源技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点，而DNA溯源技术不受人为因素影响，结果准确，并且检测手段简单快捷等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。 用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR分子标记(微卫星标记)和SNP分子标记(单核苷酸多态性)。其中SNP是最简单的多态形式，是由DNA序列中某个特定位点上的单个核苷酸发生变异而引起的序列多态性。它具有以下特点(l) 二等位基因；(2)分布广，密度大；(3)高遗传稳定性。 目前，国外采用的溯源标记包括以上三种，有的是采取其中二者的组合，但SNP分子标记逐步取代AFLP分子标记和SSR分子标记已经成为一种必然的趋势。因为相比SNP分子标记，AFLP分子标记技术技术费用昂贵，对DNA的纯度和质量要求很高；SSR分子标记等位基因数目多，带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难；因而SNP分子标记顺理成章成为DNA溯源技术的最佳分子标记。但并非所有的SNP分子标记都可以用作溯源。可以用于溯源的SNP分子标记至少具有以下特点(l)变异度高，等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布差异小。 匪P基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，匪P)是一类重要的蛋白水解酶，依据蛋白结构的相似性以及降解底物不同可分为5个亚类。匪P家族拥有26位成 员，基质溶解素匪P3便是其一。人的匪P3基因定位在染色体11q22. 3位置，长度约7. 8kb， 包括10个外显子和9个内含子。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种匪P3基因中一个用于猪肉产品DNA溯 源的新SNP分子标记，用于猪肉产品的安全性溯源。本专利技术对猪匪P3基因进行分离，并进行 SNP的寻找，进一步进行了变异度的筛选，以期获得可用于肉产品安全性溯源的分子标记。 为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现 —种匪P3基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记，它是通过在6个 猪品种或品系的试验群体(共计190个体)中，分析其匪P3基因的SNP位点等位基因的分 布情况，通过克隆测序、序列分析比较而获得。具体步骤如下 (1)在NCBI数据库中，以猪匪P3基因的mRNA序列(NMJ)01166308)为模板设计 引物分离猪匪P3基因的DNA片段，测序并分析。所得匪P3基因序列长573bp，其中包含完 整的内含子2、内含子3和完整外显子2的序列，部分外显子1和部分外显子3的序列。该 匪P3基因的序列如SEQ ID NO l所示。在其第182位碱基处有一个碱基突变182C-182T， 检测该碱基突变182C-182T的正、反向引物的DNA序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所 示。 (2)采集6个品种和品系的耳组织样，190个个体。 (3)检测SNP分子标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP分子标 记，并采用PCR-HpyF3I-RFLP方法对其进行检测。 本专利技术采用克隆子测序比较的方法检测到猪匪P3基因组片段中存在的SNP位点， 并通过在试验猪群中进行SNP分子标记变异度的分析，获得一个新的可以用于猪肉产品 DNA溯源的SNP分子标记。本专利技术的新SNP分子标记可应用于猪肉产品的安全性溯源。具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本专利技术的技术方案。 实施例1 分子标记的查找 (1)引物设计在NCB数据库中，以猪匪P3基因的mRNA序列(NM_001166308)为模板，使用Primer5. 0设计扩增引物，用于查找新SNP位点。 正向引物5 —-GCAGAAGTTCCTTGGGTTGG-3— 反向引物5— -AAACTTTTCCAGGTCCGTCAA-3— PCR反应总体积为20 ii l，其中猪基因组DNA约100ng，含1 X buffer (Promega)， 1. 5mmol/L MgCl2， dNTP终浓度为150 ii mol/L，引物终浓度为0. 2 ii mol/L， 2U Taq DNA聚合 酶(Promega) 。 PCR扩增程序是94。C 4min，然后循环35次(94°C 30s，退火56°C 30s，72。C 延伸20s)，最后72t:延伸10min。 PCR反应产物用1. 0wt^琼脂糖凝胶电泳检测。 (2)克隆测序分析将得到的匪P3基因PCR产物按照以下方法进行克隆 PCR产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1. 5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(华舜)纯化。 连接反应将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接反应总体积是10 iU，其 中包括5iU solution I，O. 5iU的T载体，2. 5iU的纯化PCR产物，最后加入2iU灭菌水置4t:水浴过夜。 感受态细胞(Competent cells)购自天根生化科技有限公司。 转化无菌状态下取100 120iU感受态细胞于1. 5ml Ependorff管中，将5 的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42t:热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出 后冰浴3 4min，加入400 y 1无抗生素的LB液体培养基，37。C平放lh后倒置培养。 菌落PCR鉴定经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37。C培养过夜，随机挑取多 个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。测序分析发现引物扩增的DNA序列长573bp， 该序列的182碱基处存在一个碱基突变(182C-182T)，通过分子生物学软件分析，发现182 碱基处的碱基突变导致HpyF3I-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＭＭＰ３基因中一个用于猪肉产品ＤＮＡ溯源的新ＳＮＰ分子标记，其特征在于，它是通过在６个猪品种或品系的试验群体中，分析其ＭＭＰ３基因的ＳＮＰ位点等位基因的分布情况，通过克隆测序、序列分析比较而获得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴潇，唐雪明，赵凯，朱宏，谭芙蓉，王金斌，蒋玲曦，陶世如，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]