一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒ＤＮＡ的方法技术

本发明专利技术公开一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒ＤＮＡ的方法，包括以下步骤：１）菌体的培养与收集；２）原生体的制备；３）细胞的裂解和质粒的提取；４）质粒的纯化。应用该方法得到的质粒ＤＮＡ可直接用来限制性内切酶消化、ＰＣＲ扩增等多种分子生物学实验。本发明专利技术操作简便、安全、质量高，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒ＤＮＡ的提取，因此具有广泛的适用性。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒ＤＮＡ的方法，其特征在于，包括以下步骤：　　１）菌体的培养与收集：挑取苏云金芽胞杆菌的单菌落于５－１０ｍｌ　ＬＢ液体培养基中３０℃振荡培养过夜，１ｗｔ％转接到５０－１００ｍｌ新鲜ＬＢ液体基中继续振荡培养，至细菌生长密度为ＯＤ↓［６００］＝０．９－１．１，收集约８０－１２０ｍｇ菌体于１．５ｍｌ离心管中；　　２）原生体的制备：向收集的菌体中加入１－１．２ｍｌ预冷的溶液Ａ悬浮细胞，１２０００ｇ离心，去上清。菌体重悬于２００－３００μｌ溶液Ｂ，３７℃温育１．５－２ｈ；　　３）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的原生质体中加入２００－３００μｌ溶液Ｃ，缓慢混匀，６８℃处理１０ｍｉｎ，裂解细胞，向裂解液中加入１００－１５０μｌ溶液Ｄ，轻轻混匀，于－２０℃中放３０ｍｉｎ；４℃１２０００ｇ离心２０ｍｉｎ，将上清液转移至新１．５ｍｌ离心管内，加入１ｍｌ无水乙醇，－２０℃过夜；４℃１２０００ｇ离心２０ｍｉｎ，弃上清，７０ｗｔ％乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入２００μｌ无菌纯水溶解沉淀；　　４）质粒的纯化：向上述ＤＮＡ溶液中加入１５０－２５０μｌ的溶液Ｅ，轻轻混匀；再加入１５０－２５０μｌ的Ｔｒｉｓ饱和酚，轻轻混匀；加入１５０－２５０μｌ的氯仿／异戊醇，轻轻混匀；１２０００ｇ离心３ｍｉｎ，小心将上层水相转移到一个新的离心管中，加入８００μｌ无水乙醇，轻轻混匀，室温放置５ｍｉｎ；１２０００ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清，７０ｗｔ％乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入４０－７０μｌ溶液Ｆ，室温放置１０ｍｉｎ；。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭芙蓉，唐雪明，赵凯，王金斌，吴潇，朱宏，陶世如，蒋玲曦，王利刚，刘华，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]