一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒，该试剂盒主要包括：包被有环丙沙星－鸡卵血清白蛋白偶联物（ＣＩＰ－ＯＶＡ）的酶标板、环丙沙星单克隆抗体、环丙沙星（ＣＩＰ）标准品溶液、酶标二抗、底物显色液、洗液、终止液。本发明专利技术还公开了一种利用上述试剂盒检测水产品中环丙沙星残留的方法，它包括以下步骤：首先对样品进行前处理，然后利用试剂盒检测，最后分析实验结果。本发明专利技术提供的试剂盒操作简便、灵敏度高、特异性强，适合大规模的样品检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)又称环丙氟哌酸，是第三代氟喹诺酮类药物。该 药杀菌能力强、抗菌谱广曾被普遍的应用在水产动物的疾病治疗中。然而人类长期食用含 环丙沙星残留的水产品会对健康造成损害，引发食源性疾病。目前，环丙沙星已经被欧盟、 中国等列为水产养殖禁用药物。 目前，环丙沙星的检测方法主要包括微生物法、高效液相色谱法、毛细管电泳法 等。这些检测方法不仅需要以实验室平台为依托，还需要有专门的实验人员进行操作。其 中微生物法虽然要求不高，但是检测的灵敏度达不到国家标准。高效液相色谱法、毛细管电 泳法虽然灵敏度高，能够进行大规模检测，但是所花费的时间长、购买仪器的费用也非常的 高一般在30万元以上。酶联免疫竞争法(ELISA)具有灵敏度高、操作简单、成本低、检测速 度快等特点，因此利用酶联免疫竞争法(ELISA)建立灵敏度高、操作简单、能快速检测水产 品中环丙沙星的试剂盒将有着十分广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、价格低廉、灵敏快速的用于检测水产品中环 丙沙星残留的酶联免疫试剂盒。 本专利技术的酶联免疫试剂盒包括包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物 (CIP-0VA)的酶标板、环丙沙星单克隆抗体、环丙沙星(CIP)标准品溶液、酶标二抗、底物显 色液、洗液、终止液。 所述包被酶标板的包被原CIP-OVA，为环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物，制备过 程如下 (1)先将鸡卵血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1_乙基_(3-甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1 : 340 : 7043混合，在室温下反应2小时； (2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24 小时换液一次；所述的磷酸缓冲液PH为5. 0，浓度为0. 01mol/L ;所述的透析袋半周长为 22mm，截留分子量为14000 ; (3)收集透析袋内的液体，在_201:预冷冻2小时，然后在-S(TC下冷冻干燥，制成 环丙沙星包被原白色固体粉末。 其中所述包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物的酶标板，是将环丙沙星-鸡 卵血清白蛋白偶联物用包被缓冲液(pH9.6，0. lmol/L的碳酸盐缓冲液)稀释到一定浓度 后，加入酶标板37°C ， lh，再用PBST (0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液加入0. 5%的吐温20)洗 涤，最后加入1%牛血清白蛋白溶液封闭过夜制得。其中所述的环丙沙星单克隆抗体是由杂交瘤细胞株JY-1 (CCTCC NO. C200947)分泌获得。 所述的环丙沙星(CIP)标准品溶液的浓度为0. lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/ mL、1000ng/mL。所述的底物显色液包括O. 03%过氧化氢，1. 5mg/mL的四甲基联苯胺和pH5. 3的醋酸钠缓冲液。 其中所述的洗液为含有0. 5%吐温20的磷酸缓冲液。 其中所述的终止液为2mol/L的硫酸。 所述的酶联免疫试剂盒检测水产品中环丙沙星残留的免疫学方法，其特征在于包 括以下步骤 (1)样品前处理取均质过的样品，加入乙腈作为提取液，捣碎匀浆，振荡离心后 取上清液；往残渣中加入提取溶剂乙腈，重复上述操作1次，合并上清液，取一定量的上清 液做分析； (2)样品检测将处理过的样品上清液和环丙沙星标准溶液分别加入酶标板，同时加入权利要求3所述的环丙沙星单克隆抗体标准溶液；温育后洗涤拍干，加入酶标抗抗体；温育后洗涤拍干，加入显色液；温育后加入终止液，用酶标仪测定吸光度值； (3)结果分析以标准溶液的抑制率B/B。为纵坐标，以不同浓度环丙沙星的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，根据标准曲线计算得出样品中的环丙沙星浓度。 本专利技术的又一目的是提供一种能够用于检测水产品中环丙沙星残留的免疫学方法，它包括以下步骤 1、样品前处理； 2、样品检测； 3、结果分析。(1)样品前处理(鲫鱼、舻鱼、鲑鱼、螃蟹、罗氏沼虫下) 取均质过的样品，加入乙腈作为提取液，高速组织捣碎机匀浆，充分振荡离心后取 上清液。往残渣中加入提取溶剂，重复上述操作l次，合并上清液，取一定量的上清液做分 析。(2)样品检测 将处理过的样品上清液和环丙沙星标准溶液分别加入酶标板，同时加入环丙沙星 单克隆抗体标准溶液；温育后洗涤拍干，加入酶标抗抗体；温育后洗涤拍干，加入显色液； 温育后加入终止液，用酶标仪测定吸光度值。 (3)结果分析 以标准溶液的抑制率B/B。为纵坐标(B是环丙沙星不同标准浓度的0D45。值，B。是 环丙沙星浓度为0时的0D45。值)，以不同浓度环丙沙星的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲 线，样品中的环丙沙星浓度可以根据标准曲线计算得出。 本专利技术具有以下优点 (1)本专利技术的试剂盒灵敏度高，最低检测限能够达到1. 02ng/mL，与以往试剂盒比较灵敏度提高i-io倍。 (2)本专利技术的试剂盒特异性强，仅有恩诺沙星存在交叉反应，对其它氟喹诺酮类药物不存在交叉反应。 (3)本专利技术的试剂盒所使用的单克隆抗体能够稀释30000-200000倍使用，与以往 试剂盒所使用单克隆抗体的稀释倍数比较，提高了 io倍以上，从而节约了成本。 (4)本专利技术中的前处理方法，操作简单易于实施。附图说明 图1为环丙沙星偶联物紫外扫描图。 图2为试剂盒标准抑制曲线。具体实施例方式(1)本专利技术所用试剂环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟 沙星，含量^ 98.5%，购自浙江国邦药业有限公司；牛血清蛋白(BSA)、鸡卵血清白蛋白 (0VA)、酶标板、HRP羊抗鼠抗抗体、四甲基联苯胺、吐温20购于鼎国生物公司；乙基碳二亚 胺(EDC)，纯度^99.3X，购自上海延长生化科技发展有限公司；1640培养基(购自GIBCO 公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；HAT (购自GIBCO公司)；小牛血清(购自HYCLONE 公司)；二甲亚砜(购自SIGMA公司)，其它化学试剂购于上海国药有限公司。 (2)Balb/c小鼠，购自上海实验动物中心；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院细胞库。 实施例一 免疫原——环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的制备 1、称取8. 5g的氯化钠、2. 85g磷酸氢二钠、0. 2g氯化钾，O. 27g磷酸二氢钾加入 950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节pH(酸碱度)至5. 0，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL， 浓度为0. Olmol/L的磷酸缓冲液。 2、称取40mg的牛血清白蛋白加入5mL的磷酸缓冲液(pH为5. 0，含量为0. 01mo1/ L)制成8mg/mL(0. 12iimol/L)的牛血清白蛋白水溶液。 3、称取100mg的环丙沙星加入5mL的磷酸缓冲液(pH为5. 0，含量为0. Olmol/L) 制成20mg/mL(60. 4 y mol/L)的环丙沙星水溶液。 4、称取960mg碳二亚胺加入4mL磷酸缓冲液(pH为5. 0，含量为0. Olmol/L)制成 240mg/mL(1251. 9 ii mol/L)的水溶液。 5、在1. 5mL的离心管中分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒，其特征在于它包括下列组分：（１）包被有环丙沙星－鸡卵血清白蛋白偶联物（ＣＩＰ－ＯＶＡ）的酶标板；（２）环丙沙星单克隆抗体；（３）环丙沙星（ＣＩＰ）标准品溶液；（４）酶标二抗；（５）底物显色液；（６）洗液；（７）终止液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨先乐，黄宣运，胡鲲，姜有声，喻文娟，陈力，付乔芳，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]