【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及医学，尤其涉及一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物及试剂盒和应用。
技术介绍
1、铜是生物体内必需的微量元素，参与细胞生长和代谢。研究表明，铜稳态紊乱与多种肿瘤有关，如胃癌和结直肠癌。如果铜的浓度超过某一阈值，就会产生毒性，诱发一种新发现的细胞死亡形式——铜死亡。当铜直接与三羧酸循环的脂酰化产物结合时，就会发生还原反应，导致含铁硫簇蛋白质的损失，蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。
2、线粒体中的铁氧还原蛋白(ferredoxin 1,fdx1)是铜死亡发生的核心分子，fdx1可以将cu2+还原为毒性更强的cu+，同时fdx1还可以使丙酮酸脱氢酶复合体中的dlat和dlst及硫辛酰化相关酶lias发生脂酰化，从而赋予其酶活性。在细胞内铜离子发生积累时，fdx1可以将cu2+还原为cu+，并催化dlat、dlst和list发生脂酰化，而cu+进一步结合到dlat的脂酰化部位，使dlat发生寡聚化，从而获得铜毒性。
3、研究发现铜离子促进了胃癌的整体m6a修饰，其中mettl16介导的fdx1mrna-m6a在促进铜死亡方面起到关键作用。具体而言，铜离子通过调控乳酰化酶和去乳酰化酶sirt2调控mettl16-k229乳酰化，从而调控其活性。乳酰化的mettl16引起fdx1-602位点发生甲基化修饰，促进fdx1表达，导致铜死亡发生。sirt2是一种典型的去乙酰化酶，其抑制剂agk2在该途径中可以显著促进mettl16的乳酰化及fdx1的m6a修饰，促进铜死亡。为此，需要能够有效的扩
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提出了一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物及试剂盒和应用。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物，引物的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
3、在以上技术方案的基础上，优选的，所述m6a甲基化修饰位点位于fdx1基因的mrna序列的33230bp，长度为1bp。
4、在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物的浓度为10～15μm。
5、第二方面，本专利技术提供了一种检测fdx1基因m6a甲基化的试剂盒，包括seq idno.1-2所示的引物。
6、在以上技术方案的基础上，优选的，还包括10～15μl sybrpremix ex taq ii 2×、2～5μl dna模板和6～8μl灭菌水。
7、第三方面，本专利技术提供了fdx1基因m6a甲基化检测的非疾病诊断治疗检测方法，包括以下步骤：
8、s1，提取组织样本rna并对提取的rna样本进行质量检测；
9、s2，对rna定量并进行免疫下拉；
10、s3，以回收的待测样本rna为模板，采用上述试剂盒进行荧光定量pcr；
11、s4，计算待测样本fdx1 mrna上游调控区域m6a修饰位点的m6a修饰程度w，分析待测样本m6a修饰检测结果。
12、在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤s1中组织样本选自胃组织样本、胃癌组织样本、胃癌转移部位组织样本。
13、在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤s3中pcr反应程序为：95℃5min；95℃10s，95℃20s，68℃20s，40个循环，95℃10s。
14、第四方面，本专利技术提供了一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物在制备检测胃癌试剂盒中的应用。
15、本专利技术的一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物及试剂盒和应用相对于现有技术具有以下有益效果：
16、(1)本专利技术针对富集目的基因特定的m6a修饰序列，设计1针对m6a修饰序列的引物，能够有效的扩增fdx1基因mrna上的m6a修饰位点区域片段，用于特异性检测对应位点的m6a修饰状态。
17、m6a修饰及m6a修饰特异性的原理：m6a修饰主要发生位点是m6a修饰位点。在正常人基因组中，fdx1 m6a修饰位点的a位点通常处于m6a修饰状态，这种m6a修饰的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，fdx1 m6a修饰位点的m6a修饰程度减少，导致mrna不能被降解，基因表达增加，肿瘤增殖和转移增加。
18、(2)本专利技术确定了fdx1基因mrna上的m6a修饰位点的具体位点和序列信息，为后续的定量检测提供基础。
19、(3)本专利技术建立的基于定量pcr检测fdx1基因m6a修饰状态的方法，优化了pcr体系及程序，再结合特异性的引物，保证了检测结果的准确性。
20、m6a修饰特异性pcr基本原理为：被m6a修饰的mrna经过m6a特异性抗体下拉后被富集，没有被m6a修饰的mrna不能被m6a特异性抗体下拉后富集，因此设计针对m6a修饰序列的引物，经过m6a特异性抗体下拉后富集被修饰的mrna，pcr扩增即可将m6a修饰与非m6a修饰的序列区分开来。(4)本专利技术建立的基于定量pcr检测fdx1基因m6a修饰状态的方法，可广泛应用于胃癌早期筛查，有效辅助判断胃癌恶性程度和是否转移。
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1.一种检测FDX1基因m6A甲基化的引物，其特征在于：引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
2.如权利要求1所述的一种检测FDX1基因m6A甲基化的引物，其特征在于：所述m6A甲基化修饰位点位于FDX1基因的mRNA序列的33230bp，长度为1bp。
3.如权利要求1所述的一种检测FDX1基因m6A甲基化的引物，其特征在于：所述引物的浓度为10-15μmol/L。
4.一种检测FDX1基因m6A甲基化的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-3任一项所述的引物。
5.如权利要求4所述的一种检测FDX1基因m6A甲基化的试剂盒，其特征在于：还包括10～15μL SYBRPremix Ex Taq II 2×、2～5μL DNA模板和6～8μL灭菌水。
6.FDX1基因m6A甲基化检测的非疾病诊断治疗检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的FDX1基因m6A甲基化检测的非疾病诊断治疗检测方法，其特征在于：所述步骤S1中组织样本选自胃组织样本、胃癌组织样本、胃癌转移部位组织样本。<...
【技术特征摘要】
1.一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物，其特征在于：引物的核苷酸序列如seq idno.1-2所示。
2.如权利要求1所述的一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物，其特征在于：所述m6a甲基化修饰位点位于fdx1基因的mrna序列的33230bp，长度为1bp。
3.如权利要求1所述的一种检测fdx1基因m6a甲基化的引物，其特征在于：所述引物的浓度为10-15μmol/l。
4.一种检测fdx1基因m6a甲基化的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-3任一项所述的引物。
5.如权利要求4所述的一种检测fdx1基因m6a甲基化的试剂盒，其特征在于：还包括10～15μl sybrpremix ex t...
【专利技术属性】
技术研发人员：成志超，匡佩，张加羽，李佳蓬，廖兴华，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：
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