基于自上而下策略和化学交联技术的蛋白质变体复合物分析方法技术

本发明专利技术涉及一种基于自上而下策略和化学交联技术的蛋白质变体复合物解析方法，其特征在于：基于化学可断裂交联剂，通过细胞原位共价交联捕获靶蛋白及其相互作用蛋白，并利用特异性相互作用富集靶蛋白及其复合物。通过化学断裂的方式断裂交联剂，释放靶蛋白复合物，获得靶蛋白变体及其相互作用蛋白变体，进一步通过自上而下技术精确鉴定靶蛋白变体及其相互作用蛋白变体。同时，通过交联质谱技术，确定靶蛋白变体的相互作用蛋白位点和相互作用网络。本发明专利技术的优点是实验操作简单快捷，可通过原位共价交联，同时获得蛋白变体及其相互作用位点信息，为靶蛋白复合物的精确鉴定提供了重要的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

一种基于自上而下策略和化学交联技术的蛋白质变体复合物解析方法，其特征在于：在细胞水平使用化学可断裂交联剂，对细胞中靶蛋白复合物进行原位共价交联捕获，从而使蛋白质与其相互作用蛋白变体之间的赖氨酸发生原位的共价交联。然后，通过靶蛋白上的亲和标签，将被交联剂共价捕获的靶蛋白复合物使用亲和标签进行特异性富集。一方面通过化学可断裂技术断裂交联剂，获得构成靶蛋白复合物的蛋白质变体，使用自上而下质谱技术精确蛋白质变体复合物；另一方面通过化学交联质谱技术分析构成复合物的蛋白质变体相互作用位点和相互作用网络。本专利技术的优点是实验操作简单快捷，可以实现对构成靶蛋白复合物的蛋白质变体的特异性的原位富集和蛋白质变体的精确鉴定，同时获得蛋白质变体之间的相互作用网络，为蛋白质变体复合物的精确鉴定提供了重要的技术支撑。

技术介绍

1、由单个基因产生的具有不同序列和/或化学修饰的多个蛋白质分子，称为蛋白质变体。蛋白质变体的多样性主要来源于基因转录(使用不同的启动子)、未成熟mrna分子的处理(选择性剪接)、翻译(选择性翻译起始、核糖体移码和终止密码子通读)以及蛋白质修饰(smith,l本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.基于自上而下策略和化学交联技术的蛋白质变体复合物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于：步骤1)交联反应的过程为，按1×107细胞中加入浓度为0.25mM-10mM的交联剂溶液0.5-1ml，将细胞混悬后，室温旋转反应5-60min；交联结束后，加入终浓度50mM的碳酸氢铵溶液淬灭反应；在4℃条件下，1000-2000rmp离心5-10min，去上清，获得共价交联的细胞，所述交联剂溶液中的溶剂为含有1％((v/v)二甲基亚砜DMSO或1％((v/v)二甲基甲酰胺的1×磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2或3所述的分析方...

【技术特征摘要】

1.基于自上而下策略和化学交联技术的蛋白质变体复合物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于：步骤1)交联反应的过程为，按1×107细胞中加入浓度为0.25mm-10mm的交联剂溶液0.5-1ml，将细胞混悬后，室温旋转反应5-60min；交联结束后，加入终浓度50mm的碳酸氢铵溶液淬灭反应；在4℃条件下，1000-2000rmp离心5-10min，去上清，获得共价交联的细胞，所述交联剂溶液中的溶剂为含有1％((v/v)二甲基亚砜dmso或1％((v/v)二甲基甲酰胺的1×磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2或3所述的分析方法，其特征在于：

4.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于：所述富集标签包括flag标签，his标签，生物素中的一种。

5.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于：步骤2)中采用细胞裂解液为np-40裂解液、ripa裂解液，或含1％(w/v)蛋白酶抑制剂的十二烷基磺酸钠(sds)/磷酸盐缓冲液(pbs)中的一种，按每1×107细胞加入0.3-1ml裂解液，超声80-120w破碎1-5min，10000-20000g转速，4℃离心5-15min，取上清液。

6.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于：步骤3)所述富集材料包括链霉亲和素磁珠，链霉亲和素琼脂糖树脂，anti-flag磁珠，anti-his磁珠中的一种，按照1ml细胞裂解液加入50-200μl富集材料的比例，将富集材料加入步骤2)的上...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，杨雪，梁玉，王超，孙悦，赵宝锋，杨开广，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：