一种荧光定量ＰＣＲ检测微小原甲藻的方法技术

本发明专利技术涉及一种荧光定量ＰＣＲ检测微小原甲藻的方法，包括：（１）藻液的预处理：抽取样品藻液，离心收集细胞，然后用缓冲液洗涤后重悬，得待处理藻液；（２）荧光定量ＰＣＲ引物及浓度优化：引物序列ＰＭ－１ｉＦ：ＣＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡ，ＰＭ－１ｉＲ：ＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡ；引物终浓度为：２００ｎｍｏｌ／Ｌ；（３）微小原甲藻的细胞检测：将待处理藻液经处理后进行荧光定量ＰＣＲ扩增，根据回归方程计算得到微小原甲藻的细胞个数及ＤＮＡ含量。该方法具有操作简单，对环境友好，检测结果准确等优点，建立的标准曲线灵敏度高重复性好，标准曲线各点之间成高度线性，在藻类鉴定领域具有良好的应用前景。

Method for detecting small dinoflagellate by fluorescent quantitative PCR

Including the method, the invention relates to a fluorescent quantitative PCR detection of Prorocentrum: (1) the pretreatment of algae liquid sample: algae liquid, cells were collected, and then washed with buffer after heavy suspension, algae liquid to be treated; (2) fluorescence quantitative PCR primers and primer concentration optimization: the sequence of PM - 1iF:CCCCCATGCAGAGACTCAA, PM - 1iR:CAGCAAGGACAGGCACAGAA; the final concentration of primers: 200nmol / L; (3) cell detection of Prorocentrum: to treat algae liquid after treatment for PCR amplification, and calculate the cell number and DNA content of Prorocentrum minimum according to the regression equation. This method has the advantages of simple operation, friendly to the environment, has the advantages of accurate detection results, the standard curve of high sensitivity and good repeatability, each point standard curve is highly linear, and has good application prospect in the field of identification of algae.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属微小原甲藻的检测鉴定领域，特别是涉及一种荧光定量PCR检测微小原 甲藻的方法
技术介绍
对赤潮进行预测首要问题是对赤潮藻类进行检测，传统的藻类鉴定是通过形态学 的观察来划分的，从色素，色素体，贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，这是一件 费时费力的事，而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难以胜任这项 工作，并且环境对藻类形态有很大影响，鉴定到种存在的困难较多。目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解 决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)技术专利技术以来，这种技术就被应用到诸多领域。许多学者通过微藻 某些基因片段扩增来对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析，核糖体间隔区 (ITS)的PCR扩增和测序，从而完成对微藻类的种类鉴定，然而这种方法灵敏度不高，而且 无法定量，即不能确定水体中藻细胞数量。荧光原位杂交也是近年来微藻鉴定的检测手段， 有些学者利用核糖体大亚基(LSU)和ITS区分子探针对某些赤潮微藻进行了鉴定，但是这 种技术对探针要求高，而且定量效果差。实时荧光定量PCR检测成为近年来微藻检测一个 热点方向，该方法非常灵敏，虽然所需的实验仪器(荧光定量PCR仪)价格昂贵，但是仍有 不少实验室利用该技术鉴定了多种微藻。微小原甲藻(prorocentrum minimum)是中国海域多发赤潮藻，近年来引起多起赤 潮，因此，对该藻类进行有效灵敏的检测以避免赤潮的发生，成为了目前最受人们关注的话题。专利
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种荧光定量PCR检测微小原甲藻的方法，该 方法具有操作简单，对环境友好，检测结果准确等优点，建立的标准曲线灵敏度高重复性 好，标准曲线各点之间成高度线性，而且在30个循环内就可以检测到0.5个细胞和IOpg基 因组DNA，在藻类鉴定领域具有良好的应用前景。本专利技术的一种荧光定量PCR检测微小原甲藻的方法，包括(1)藻液的预处理抽取样品藻液，离心收集细胞，然后用pH 7. 0的PBS缓冲液洗涤两次后重悬，制成 密度为2. 5X108cell/L的待处理藻液；(2)荧光定量PCR引物设计与特异性验证从GenBank获得微小原甲藻ITS序列并与其他微藻的相对应序列进行比对分析， 选择ITS区域中与其它微藻有显著差异的ITSl区，用Primer Express 3. 0设计出适合于 SYBRGreen I法的荧光 量引物，引物序列为 PM-IiF CCCCCATGCAGAGACTCAA,PM-IiR CAGCAAGGACAGGCACAGAA ；将设计引物与GenBank中序列进行Blast比对，验证引物的特异性，优化引物终浓 度至200nmol/L，然后分别对不同种藻的破碎藻液进行荧光定量PCR扩增，扩增结果表明含 微小原甲藻DNA的样品有扩增，其他对照微藻样品无扩增；(3)微小原甲藻的细胞个数和基因组DNA检测取步骤(1)中得到的待处理藻液于离心管中，在冰浴中进行超声波处理，显微镜 观察直至所有细胞均被破碎，将藻液按1 10倍稀释，5个稀释度，每个稀释度重复3次，然 后进行荧光定量PCR扩增。微小原甲藻DNA的扩增序列如下cccccatgcagagactcaagggcagcaagccaggctcagaccgtcttctgtgcctgtccttgctg,长 度 65bp。荧光定量PCR结果得到的回归系数为0.989，说明用该方法建立的标准曲线灵敏 度高重复性好，标准曲线各点之间成高度线性，然后根据回归方程y = -3. 277x+43. 708其中x为细胞数，y为Ct值，计算得出微小原甲藻的细胞个数；用CTAB法提取微小原甲藻基因组DNA，用Biophometre (德国Eppendof公司)检 测原始DNA初浓度，然后将基因组DNA进行1 10倍稀释，7个稀释度，每个稀释度重复3 次，最终检测DNA含量。所述步骤(3)中的超声波处理为超声功率200W、超声时间3秒、间隔时间3秒；所述步骤(3)中的荧光定量PCR扩增的条件为94°C 10min,94°C 15s,60°C lmin, 40个循环；溶解曲线94 °C 15s, 60 °C lmin, 94 °C 15s，扩增体系为20yL体系，2yL基 因组 DNA，10yL 2 X Power SYBR Green Mater mix，引物 PM-liF 和 PM-liR(初浓度为 10 μ Μ) 0. 4 μ L(引物终浓度为 200nmol/L)，7· 2μ L ddH20。有益效果本专利技术的荧光定量检测方法具有操作简单，对环境友好，检测结果准确等优点，建 立的标准曲线灵敏度高重复性好，标准曲线各点之间成高度线性，而且在30个循环内就可 以检测到0. 5个细胞和IOpg基因组DNA，在藻类鉴定领域具有良好的应用前景。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1标准曲线的绘制(1)藻液的预处理将生长到对数期的微小原甲藻藻液和其他对照微藻(链状亚历山大藻，环状异 帽藻，米氏凯伦藻，短凯伦藻，角毛藻)藻液，离心收集细胞，进行显微镜计数，然后再用 PBS(PH7. 0)缓冲液洗涤两次后重悬，制成密度为2. 5X 108cell/L的待处理藻液；4(2)荧光定量PCR引物设计与特异性验证从GenBank获得微小原甲藻ITS序列并与其他微藻的相对应序列进行比对分析， 选择ITS区域中与其它微藻有显著差异的ITSl区，用Primer Express 3. 0设计出适合于 SYBRGreen I法的荧光定量引物，引物序列为PM-IiF CCCCCATGCAGAGACTCAA,PM-IiR CAGCAAGGACAGGCACAGAA ；将设计引物与GenBank中序列进行Blast比对，设计引物，优化引物浓度，然后选 择200nmol/L的引物终浓度，用其他对照藻做为对照验证引物的特异性，分别对不同种藻 的破碎藻液进行荧光定量PCR扩增，扩增结果表明含微小原甲藻DNA的样品有扩增，其他对 照微藻样品无扩增；(3)灵敏度检测取(1)中得到的IOmL待处理微小原甲藻藻液于50mL离心管中，在冰浴中进行超 声波处理(功率200W、超声时间3秒、间隔时间3秒)，显微镜观察直至所有细胞均被破碎； 将藻液按1 10倍稀释(从5000个细胞到0.5个细胞)，5个稀释度，每个稀释度3个重 复；然后进行荧光定量PCR扩增，扩增条件94°C 10min,94°C 15s,60°C lmin,40个循环。根据结果得标准回归方程y = -3. 277x+43. 708，其中χ为细胞数，y为Ct值；用CTAB法提取微小原甲藻基因组DNA，用Biophometre (德国Eppendof公司)测 原始DNA初浓度为50ng/ μ L，把基因组DNA按照1 10倍稀释(从IOOng到I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光定量ＰＣＲ检测微小原甲藻的方法，包括：　　（１）藻液的预处理　　抽取海域中的样品藻液，离心收集细胞，然后用ｐＨ　７．０的ＰＢＳ缓冲液洗涤两次后重悬，制成密度为２．５×１０↑［８］ｃｅｌｌ／Ｌ的待处理藻液；　　（２）荧光定量ＰＣＲ引物及浓度优化　　ＳＹＢＲ法的荧光定量引物序列为：　　ＰＭ－１ｉＦ：ＣＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡ，　　ＰＭ－１ｉＲ：ＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡ；　　引物终浓度为：２００ｎｍｏｌ／Ｌ；　　（３）微小原甲藻的细胞个数和基因组ＤＮＡ检测　　取步骤（１）中得到的待处理藻液于离心管中，在冰浴中进行超声波处理，显微镜观察直至所有细胞均被破碎，将藻液按１∶１０倍稀释，５个稀释度，每个稀释度重复３次，然后进行荧光定量ＰＣＲ扩增，微小原甲藻ＤＮＡ的扩增序列如下：　　ｃｃｃｃｃａｔｇｃａｇａｇａｃｔｃａａｇｇｇｃａｇｃａａｇｃｃａｇｇｃｔｃａｇａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｇｔｇｃｃｔｇｔｃｃｔｔｇｃｔｇ，长度６５ｂｐ。　　然后根据回归方程，计算得出微小原甲藻的细胞个数；　　用ＣＴＡＢ法提取微小原甲藻基因组ＤＮＡ，采用Ｂｉｏｐｈｏｍｅｔｒｅ检测原始ＤＮＡ初浓度，然后将基因组ＤＮＡ进行１∶１０倍稀释，做７个稀释度，作为荧光定量模板，每个稀释度重复３次，最终检测ＤＮＡ含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤英，马凌波，石彦红，蒋科技，马春艳，马洪雨，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]