【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条及其制备方法与应用。
技术介绍
1、犬细小病毒(canine parvovirus，cpv)属于细小病毒科(parvoviridae)细小病毒属(parvovirus)。cpv基因组由单股dna组成，dna量约占整个病毒粒子重量的25％～34％，dna的分子质量为1.4×106～1.7×106，沉淀系数为23s～27s。我国已建立的用于检测cpv抗体的血清学方法有血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验、胶体金免疫层析试纸条等。酶联免疫吸附实验(elisa)既可检测抗原又可检测抗体，该方法有高效、快速、灵敏的特点。但该方法无法分辨是野毒感染还是疫苗免疫。随着分子生物学技术的快速发展，pcr技术为cpv的检测提供了一种灵敏可靠的检测技术，pcr检测敏感性高，特异性强，可分辨野毒感染和疫苗免疫。近年来，随着胶体金免疫层析方法的进一步发展，利用胶体金标记cpv单克隆抗体，制成检测cpv抗原的胶体金检测试纸已应用于兽医临床中。但胶体金免疫层析法存在灵敏度不高等缺陷。
2、综上所述，以上方法有些对操作环境和精密设备的需求较高，限制了其应用范围，有的方法虽方便快捷，但存在灵敏度不高，有假阳性的问题。因此，亟需建立一套快速简便、准确的检测方法，为cpv现地快检、病原的监测预警提供新型的检测技术与物质基础。
技术实现思路
1、为解决现有的检测cpv的方法存在的技术问题，本专利技术基于聚集诱导发光材料(aie)的特性，结合
2、为解决上述技术问题，并实现相应的技术效果，本专利技术提出了如下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种用于快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括pvc底板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜、吸水垫、结合垫和样品垫依次搭接在pvc底板上；所述的层析膜上设有检测线t和质控线c，其中，质控线c包被有羊抗鼠igg，检测线t包被有抗cpv的单克隆抗体；所述的检测线t设置于靠近结合垫的一端，所述的质控线c设置于靠近吸水垫的一端；所述结合垫包被有荧光微球标记的抗cpv的单克隆抗体；所述荧光微球为由硬脂微球包裹具有aie特性的化学发光材料(bf-tpa2)制备获得的纳米颗粒，bf-tpa2为一种聚集诱导发光材料，该类材料在聚集状态下表现出优异的发光性能，且具有良好的水溶性、稳定性、不容易猝灭性。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述样品垫为玻璃纤维素膜，所述结合垫为聚酯纤维素膜，所述层析膜为硝酸纤维素膜，所述吸水纸为棉绒材质。
5、本专利技术的第二个目的是提供一种含有上述用于快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条的试剂盒。
6、本专利技术的第三个目的是提供上述用于快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：
7、(1)结合垫的制备：
8、①将结合垫置于结合垫封闭液中进行浸泡处理，然后烘干备用；
9、②将由硬脂微球包裹的bf-tpa2材料所制成的荧光微球经振荡后进行离心，取沉淀，利用双蒸水重悬，离心取沉淀，加入mes缓冲液重悬，再依次添加n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活化荧光微球表面的羧基，经超声摇床条件下反应后、离心取沉淀，再用hepes缓冲液重悬，超声，边振荡边加入抗cpv的单克隆抗体，经孵育后加入10％bsa封闭，经离心取沉淀，利用重悬液重悬，超声获得抗cpv的单克隆抗体标记的荧光微球溶液；
10、③将②中制备的抗cpv的单克隆抗体标记的荧光微球稀释后均匀喷洒在结合垫上，经烘干制成结合垫备用；
11、(2)样品垫的制备：将样品垫浸泡于样品垫封闭液中，经烘干备用；
12、(3)硝酸纤维膜的制备：
13、将抗cpv的单克隆抗体稀释后，加入包被液和蔗糖溶液混合后，喷于硝酸纤维膜的检测线t处，将羊抗鼠igg抗体与检测线间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，作为质控线c，硝酸纤维膜经干燥备用；
14、(4)试纸条的组装：
15、在pvc底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫进行连接，得到试纸条，检测线t设置于靠近结合垫的一端，质控线c设置于靠近吸水垫的一端。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述结合垫封闭液为含有5％海藻糖、2％bsa、0.5％tween-20、0.5％triton x-100的硼酸溶液。
17、在本专利技术的一种实施方式中，由硬脂微球包裹的bf-tpa2材料所制成的荧光微球的具体制备方法如下：将ps微球液分散于溶胀介质thf中，再将bf-tpa2溶于溶胀溶剂中，二者混合在一起之后进行溶胀反应；在溶胀反应期间，间隔1-2h进行1-10min的超声处理；溶胀反应结束后，在适当温度下通过蒸发去除溶胀剂，在蒸发掉溶胀剂后对微球液先进行1-15min的超声处理，再进行稀释去除溶胀介质后获得荧光微球沉淀物。
18、在本专利技术的一种实施方式中，步骤②的具体方法为100μl由硬脂微球包裹的bf-tpa2材料所制成的荧光微球加入1.5ml离心管中，振荡混匀；4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，用100μl的双蒸水重悬微球沉淀，再次在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃去上清，用1ml 20mm，ph＝5.6的4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液重悬荧光微球，以清除荧光微球中的杂质，再依次加入25μl 10mg/ml的n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化荧光微球羧基后，120w超声5min后放入37℃、200rpm摇床摇晃反应1h，以活化荧光微球表面的羧基；4℃、12000rpm条件下离心10min以清除上清中未反应的edc和nhs；加入1ml 20mm，ph＝8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液重悬微球沉淀，120w超声5min；然后将荧光微球边振荡边加入2.49mg/ml的抗cpv的单克隆抗体，在37℃摇床里孵育2h；再加入10μl 10％bsa封闭荧光微球表面活化的羧基，37℃摇床封闭1h，然后4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，用重悬液重悬，120w超声5min，使荧光微球均匀分散在溶液里，4℃保存备用。
19、在本专利技术的一种实施方式中，每1ml抗cpv的单克隆抗体标记的荧光微球溶液中含160μg抗cpv单克隆抗体。
20、在本专利技术的一种实施方式中，所述样品垫封闭液为含有0.5％tween-20、2％peg20000、2％bsa的硼酸溶液。
21、在本专利技术的一种实施方式中，硝酸纤维膜的制备方法具体如下：
22、将抗cpv的单克隆抗体稀释至1mg/ml，加入0.05m的包被液和1％的蔗糖溶液混合后，喷于硝酸纤维膜的检测线本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC底板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜、吸水垫、结合垫和样品垫依次搭接在PVC底板上；层析膜上设有检测线T和质控线C，其中，质控线C包被有羊抗鼠IgG，检测线T包被有抗CPV的单克隆抗体；检测线T设置于靠近结合垫的一端，质控线C设置于靠近吸水垫的一端；结合垫包被有荧光微球标记的抗CPV的单克隆抗体，荧光微球为由硬脂微球包裹BF-TPA2获得的纳米颗粒，BF-TPA2为一种聚集诱导发光材料。
2.一种含有权利要求1所述荧光免疫层析试纸条的试剂盒。
3.权利要求1所述荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，结合垫封闭液为含有5％海藻糖、2％BSA、0.5％Tween-20、0.5％Triton X-100的硼酸溶液。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，每1mL抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球溶液中含160μg抗CPV单克隆抗体。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述
7.权利要求1所述荧光免疫层析试纸条或权利要求2所述试剂盒在非疾病诊断目的的检测CPV中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将样品稀释后滴加在试纸条加样孔中，室温静置20min，用紫外灯365nm照射试纸条观察结果，待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性；如果质控线不显色，则检测无效。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，当样品为粪便样品或肛试子时，预处理方法为样品中加入1mLPBS，振荡后离心收集上清。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述稀释为取10μL预处理后的样品，加入90μL CPV稀释液进行稀释。
...【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括pvc底板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜、吸水垫、结合垫和样品垫依次搭接在pvc底板上；层析膜上设有检测线t和质控线c，其中，质控线c包被有羊抗鼠igg，检测线t包被有抗cpv的单克隆抗体；检测线t设置于靠近结合垫的一端，质控线c设置于靠近吸水垫的一端；结合垫包被有荧光微球标记的抗cpv的单克隆抗体，荧光微球为由硬脂微球包裹bf-tpa2获得的纳米颗粒，bf-tpa2为一种聚集诱导发光材料。
2.一种含有权利要求1所述荧光免疫层析试纸条的试剂盒。
3.权利要求1所述荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，结合垫封闭液为含有5％海藻糖、2％bsa、0.5％tween-20、0.5％triton x-100的硼酸溶液。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，每1ml抗cpv...
【专利技术属性】
技术研发人员：李媛媛，刘雨非，李博一，王化磊，刘伟，黄培，张海丽，陈泺同，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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