一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法。该方法是以二化性家蚕实用品种“秋丰”为材料，从越年蚕卵丙↓［２］胚胎期开始用１５℃～２０℃的温度黑暗催青，胚胎发育至己↓［５］期时用２５℃～２６℃继续催青至孵化。孵化后正常温度饲养和蛰中保护，羽化后雌、雄蛾交配制种，获得子代非滞育蚕卵，经适当消毒处理后用显微注射法制作转基因家蚕。转基因操作后的蚕卵在正常温度湿度条件下催青即能孵化。本发明专利技术解决了家蚕二化性实用品种因蚕卵滞育而不能直接用显微注射法制作转基因家蚕的难题，将极大地促进家蚕种质创新、家蚕转基因实用品种的培育和自主式家蚕生物反应器的开发。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，属于生物学技术 领域。专用于家蚕二化性实用品种蚕卵显微注射法制作转基因家蚕。
技术介绍
自上世纪70年代以来，研究人员对家蚕转基因技术进行了大量艰苦的试验， 建立了精子介导法、基因枪法、显微注射法、病毒介导法、孤雌生殖法等多种外 源基因导入方法，利用同源重组原理进行转基因尝试。但是由于没有理想的转座 子载体加上蚕卵壳坚硬等原因，使家蚕转基因的研究进展缓慢。最近，从昆虫中 鉴定出多个可作为鳞翅目昆虫转基因载体的转座子P因子、Hermes、 minos、 hobo、 mariner和PiggyBac等，成功地在昆虫转基因中得到了应用。/^>gj^sc 转座子对家蚕也有转座作用，已经利用'^ j5ac转座子通过显微注射方法获得 了稳定遗传的转基因系统，在研究家蚕重要功能基因、幵发生物反应器和害虫防 治等方面具有极大的优势。由于现行生产上使用的家蚕品种基本上为二化性品种，产卵后需要采用盐 酸处理等人工方法才能孵化；而且大多数品种卵壳比较坚硬，难以直接作成以 提高和改进蚕丝产量和质量为目标的转基因家蚕，制约了家蚕实用品种转基因 的研究。多化性品种尤其是无滞育期的多化性品种，在胚胎发育早期(2h 8h) 转基因显微注射后，不需要进行盐酸刺激处理就可以直接催青孵化，这也是迄 今作成的转基因都是Nistari等多化性品种的原因。然而多化性品种除了抗性 强外，茧丝质性状都比较差，实用价值很低。目前蚕茧生产中使用的家蚕品种 几乎都为二化性品种。如果能够建立一种蚕种处理方法，使二化性品种的蚕卵 在进行转基因操作(显微注射)后不经过盐酸刺激可以直接催青孵化，那无疑 将极大地促进家蚕种质创新研究和转基因实用蚕品种培育以及作为生产贵重药 用蛋白质的自主式家蚕生物反应器的开发。
技术实现思路
为了解决上述的二化性家蚕品种转基因存在的技术问题，本专利技术提供一种 二化性家蚕蚕卵的制备方法，使二化性家蚕实用品种的蚕卵在进行转基因操作 (显微注射)后不需要经过盐酸刺激等处理而直接催青孵化。为了达到上述的目的，本专利技术是通过以下技术方案得以实现。 一种二化性家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，其步骤如下-(1) 家蚕实用品种的准备选择家蚕二化性实用品种，以正常饲养繁殖制备的越年蚕卵为亲本材料；(2) 亲本蚕卵胚胎发育的调节将经过冬季冷藏3(T60日胚胎活化的越年蚕 卵置于10-15'C的环境中，调节胚胎发育至丙2期；(3) 亲本蚕卵的催青从蚕卵丙z胚胎期开始，采用15 2(TC温度催青，胚 胎发育至己5期即蚕卵转青时改用正常温度催青，直至蚕卵孵化获得幼虫；(4) 亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备将步骤(3)中孵化获得的幼虫， 按品种分别饲养，羽化后同一品种的雌蛾与雄蛾交配，制备获得的子代蚕卵即为 非滞育蚕卵。上述的步骤(1)所述的家蚕二化性实用品种为中国系统品种。 上述的步骤(3)所述的催青为采用黑暗催青；所述的胚胎发育至己5期为 经过30—18天。有益效果本专利技术以二化性家蚕实用品种为材料，采用15 18'C温度催青，经过30 18日胚胎发育至己5期(转青期)时改用25 26。C催青，再经过2日蚕卵孵化。 孵化的蚁蚕釆用正常温度饲养和保护，羽化后雌、雄蛾交配制种获得的子代蚕 卵为非滞育蚕卵，其发育类似多化性品种，在正常温度湿度条件下，产下后经 过9 10日即能孵化成蚁蚕，良卵孵化率达到96%以上。在这种蚕卵的胚胎发育 早期经适当的消毒处理后直接用于显微注射法制作转基因家蚕，使二化性家蚕 实用品种转基因操作后不需要经过盐酸刺激等处理就能直接催青孵化，解决了 家蚕实用品种转基因中滞育卵不能及时孵化的难题。本专利技术成果国内外尚未见类似报道。本专利技术成果有良好的应用前景，其应用将极大地促进家蚕种质创新研究和 转基因实用蚕品种培育以及作为贵重药用蛋白质生产的自主式家蚕生物反应器 的开发，从而提高我国蚕业科技水平和经济效益，实现从蚕丝大国到蚕丝强国 的转变。附图说明图1为家蚕品种秋丰越年蚕卵经17-17. 5'C温度黑暗催青饲养获得的子 代非滞育蚕卵(点青期)；图2为家蚕品种秋丰越年蚕卵经25-25. 5'C温度正常催青后饲养获得 的子代滞育卵圈(灰紫色)。具体实施例方式下面结合实例对本专利技术一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法作 进一步描述一、 家蚕品种秋丰[公知公用，见参考文献章佩祯，季平，沈雪华 等.夏秋用蚕品种秋丰X白玉的育成.蚕业科学，1994 (1) : 17-25]二、 来源由中国农业科学院蚕业研究所培育和保存的家蚕品种，并对外 提供。三、 主要特征特性中系二化性四眠品种；幼虫具有限性斑纹，雌蚕为普 斑、雄蚕为素蚕，蚕体粗壮，食桑旺盛，发育整齐，体质较强；老熟齐涌，熟 蚕有趋密性，多营上层茧；越年卵正常催青经过IO日，幼虫期经过22日，蛰 中经过13 14日；茧形椭圆，茧色洁白，縮皱中等；全茧量1.8 g 2.0g，茧 层率21%，茧丝长1000 m以上，解舒良好；羽化集中，雄蛾活泼、交配性能较 好，雌蛾产卵性能良好，单蛾产卵数450粒 600粒，卵壳色有淡黄色和白色两 种。四、 制备方法 实例1:(1)亲本蚕卵胚胎发育的调节以二化性家蚕实用品种秋丰越年蚕卵为材料，待滞育蚕卵活化后在12'C 13'C的环境中，调节胚胎发育至丙2期。(2) 亲本蚕卵(种)的催青丙2胚胎期开始，采用17。C 17.5。C温度黑暗 催青，经过25日胚胎发育至己5期时，转移到25t:-26。C继续催青，再经过2日 蚕卵孵化获得幼虫，良卵孵化率90.23%。(3) 亲代家蚕的词养和非滞育蚕卵的制备步骤(2)获得的幼虫采用正常 温度饲养，羽化后雌蛾与雄蛾交配制种，获得子代非滞育蚕卵。以卵圈计算，非 滞育卵率达到96. 39%以上，非滞育卵孵化率96. 11%。二化性家蚕实用品种秋丰亲代越年蚕卵采用17'C 17.5t:温度黑暗催 青，获得的子代蚕卵非滞育卵率高。 实例2:(1) 亲本蚕卵胚胎发育的调节按照实例1的方法，调节秋丰越年蚕卵 胚胎发育至丙2期。(2) 亲本蚕卵(种)的催青丙2胚胎期开始，采用15'C 15.5t:温度黑暗 催青，经过30日胚胎发育至己5期时，转移到25'C-26'C继续催青，再经过2日 蚕卵孵化获得幼虫。良卵孵化率68.63%，蚁蚕体质虚弱。(3) 亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备步骤(2)获得的幼虫采用正常 温度饲养，羽化后雌蛾与雄蛾交配制种，获得子代非滞育卵。以卵圈计算，非滞 育卵率达100%，孵化率95. 86%。二化性家蚕实用品种秋丰亲代越年蚕卵采用17'C 17.5X:温度黑暗催 青，获得的子代蚕卵100%为非滞育卵。但是，因亲代蚕种催青时间过长，幼虫 体质虚弱，饲养困难。实例3:(1) 亲本蚕卵胚胎发育的调节按照实例1的方法，调节秋丰越年蚕卵 胚胎发育至丙2期。(2) 亲本蚕卵(种)的催青丙2胚胎期开始，采用19.5。C 20.(TC温度黑 暗催青，经过14日胚胎发育至己5期时，转移到25。C-26。C继续催青，再经过2 日蚕卵孵化获得幼虫。良卵孵化率92. 17%。(3) 亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备步骤(2)获得的幼虫采用正常 温度词养，羽化后雌蛾与雄蛾交配制种，获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，其特征包括如下步骤：　（１）家蚕实用品种的准备：选择家蚕二化性实用品种，以正常饲养繁殖制备的越年蚕卵为亲本材料；　（２）亲本蚕卵胚胎发育的调节：将经过冬季冷藏３０～６０日胚胎活化的越年蚕卵置于１０－１５℃的环境中，调节胚胎发育至丙↓［２］期；　（３）亲本蚕卵的催青：从蚕卵丙↓［２］胚胎期开始，采用１５～２０℃温度催青，胚胎发育至己↓［５］期即蚕卵转青时改用正常温度催青，直至蚕卵孵化获得幼虫；　（４）亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备：将步骤（３）中孵化获得的幼虫，按品种分别饲养，羽化后同一品种的雌蛾与雄蛾交配，制备获得的子代蚕卵即为非滞育蚕卵。

【技术特征摘要】
1、一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，其特征包括如下步骤(1)家蚕实用品种的准备选择家蚕二化性实用品种，以正常饲养繁殖制备的越年蚕卵为亲本材料；(2)亲本蚕卵胚胎发育的调节将经过冬季冷藏30～60日胚胎活化的越年蚕卵置于10-15℃的环境中，调节胚胎发育至丙2期；(3)亲本蚕卵的催青从蚕卵丙2胚胎期开始，采用15～20℃温度催青，胚胎发育至己5期即蚕卵转青时改用正常温度催青，直至蚕卵孵化获得幼虫；(4)亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备将步骤(3)中孵化获...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈兴家，唐顺明，赵巧玲，陈丽媛，张国政，郭锡杰，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]