基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于量子点共振能量转移检测ＨＢＶ　ＤＮＡ及单碱基突变的方法，包括：ＭＰＡ包裹的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ核／壳结构量子点的制备；ＨＢＶ　ＤＮＡ检测探针的设计及合成；ＱＤｓ－ＤＮＡ探针交联物的制备；互补的靶ＨＢＶ　ＤＮＡ及单碱基突变的高通量检测。该方法操作简单，可以与多种仪器兼容，不需要对杂交体系中未联接的ＤＮＡ进行分离；由于Ｃｙ５在４８５ｎｍ光激发下不会直接产生荧光信号，因此背景干扰小，信号强；该方法还具有特异、快速、高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，可应用于临床医学中ＨＢＶ靶ＤＮＡ及单碱基突变的检测。

Method for detecting HBV, DNA and single base mutation based on resonance energy transfer of quantum dots

The invention relates to a method for detection of HBV and DNA, single base mutation quantum dot resonance energy transfer which is based on CdSe / ZnS core / shell quantum dots MPA package preparation; design and synthesis of HBV DNA detection probe; QDs DNA probe conjugates prepared HBV and DNA complementary target; the single base mutation of high-throughput detection. The method is simple, can be compatible with a variety of instruments, do not need to separate not connected hybrid system DNA; because the Cy5 under the 485nm excitation light produces no direct fluorescent signal, so the low background noise, the signal is strong; the method also has specific, rapid, high resolution rate, high sensitivity and high throughput. It can be used in clinical medicine, DNA and HBV target detection of single base mutations.

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于量子点共振能量转移检测ＨＢＶ　ＤＮＡ及单碱基突变的方法，包括：　（一）检测探针的制备　（１）巯基丙酸包裹的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ核／壳结构量子点的制备　取０．５ｍＬ荧光发射峰为５７５～６１５ｎｍ的三辛基氧化磷ＴＯＰＯ包 裹的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ核／壳结构ＱＤｓ的甲苯溶液，加入２～４ｍＬ氯仿，再逐滴加入２～４ｍＬ的巯基丙酸ＭＰＡ溶液，室温搅拌３０～６０分钟，加入５～８ｍＬ水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的ＱＤｓ溶于Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超纯水中，制备得到ＭＰＡ包裹的水溶性ＣｄＳｅ／ＺｎＳ　ＱＤｓ；　（２）ＨＢＶ　ＤＮＡ检测探针的设计及合成　－ＮＨ↓［２］修饰过的单链探针ＤＮＡ：５′－ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＴ（Ｔ）↓［１０］（ＣＨ↓［２］） ↓［３］－（ＮＨ↓［２］）－３′；　－Ｃｙ５标记的信号ＤＮＡ探针：５′－Ｃｙ５－ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＡＴＡ－３′；　互补的靶ＨＢＶ　ＤＮＡ：５’ＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡ－ ３’；　单碱基变异ＨＢＶ　ＤＮＡ：５’－ＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡ－３’；　（３）ＱＤｓ－ＤＮＡ探针交联物的制备　将０．５ｇ／Ｌ的１－乙基－３－（３－二甲基氨丙基）－碳化二亚胺ＥＤＣ、０ ．５ｇ／Ｌ　Ｎ－羟基琥珀酰亚胺ＮＨＳ和０．０５μＭ的ＭＰＡ－ＱＤｓ按体积比１～２∶１～２∶２～６比例混合，活化０．５～２ｈ，加入上述－ＮＨ２功能化修饰过的单链探针ＤＮＡ，于３７℃孵化１ｈ，制备得到ＱＤｓ－ＤＮＡ探针交联物；　（二）互 补靶ＨＢＶ　ＤＮＡ及单碱基突变的检测　（１）基于量子点共振能量转移的ＨＢＶ靶ＤＮＡ高通量检测　向１００μＬ杂交液中加入８０μＬ　ＱＤｓ－ＤＮＡ探针、１０μＬ　１０μＭ的Ｃｙ５标记的信号ＤＮＡ探针和１０μＬ　４０～５００ｎ Ｍ互补的靶ＨＢＶ　ＤＮＡ，然后将该混合液于４２～５０℃反应１５－３０ｍｉｎ，杂交得到“三明治”结构杂交结合体，冷却至室温，将互补的靶ＨＢＶ　ＤＮＡ的杂交反应液转移至９６孔板中，用Ｗａｌｌａｃ　１４２０酶标仪检测杂交反应液６７０ｎｍ处的 荧光发射强度，从而实现对互补的靶ＤＮＡ检测和定量；　（２）基于量子点共振能量转移的ＨＢＶ　ＤＮＡ单碱基突变的检测　将７０μＬ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛红菊，王祥，钟新华，赵建龙，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：31[]