一种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用。本发明专利技术通过ＩＲＥＳ将ｃａｓｐａｓｅ－３Ｐ１７亚基基因和ｃａｓｐａｓｅ－３Ｐ１２亚基基因融合形成转录融合双基因，将该转录融合双基因插入真核表达载体得到的重组表达载体可以在转染细胞中高效地表达活性形式的ｃａｓｐａｓｅ－３，从而激活细胞凋亡信号通路，促进细胞凋亡。将本发明专利技术的重组表达载体转入癌细胞，可以有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，为基因治疗提供新的手段。本发明专利技术的重组表达载体可以用于制备诱导癌细胞凋亡的药物或抗癌药物。本发明专利技术将生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。

Vector capable of inducing apoptosis of cancer cell and application thereof

The invention discloses a carrier for inducing apoptosis of cancer cells and an application thereof. The present invention by IRES will form a transcriptional fusion double gene fusion caspase 3P17 subunit gene caspase and 3P12 subunit gene, the transcriptional fusion double gene into eukaryotic expression vector to get the recombinant expression vector can express the active form of caspase efficiently in transfected cells 3, to activate the signal pathway of apoptosis, promote cell apoptosis. The recombinant expression vector transferred into cancer cells can effectively induce apoptosis of tumor cells and provide a new means for gene therapy. The recombinant expression vector of the invention can be used for preparing drugs or anticancer drugs for inducing apoptosis of cancer cells. The invention plays an important role in the research of the biological medicine field and the gene function, and has broad application prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用。
技术介绍
caspase-3是参与细胞凋亡信号通路中众多半胱天冬酶的一种，正常情况下 caspase-3以无活性酶原的形式存在于细胞浆中。当细胞在一系列内源性基因的调 控下要发生凋亡时，处于细胞凋亡信号通路上游起始凋亡的半胱天冬酶便被激活， 而caspase-3正是被这些上游的caspases激活，生成活化的caspase-3 p17和p12 亚基，两种亚基再组装成活性形式的ca印ase-3，发挥其执行凋亡的功能。所以 caspase-3通常被认为是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。目前，虽然双启动子载体可用于两个基因的协同表达,但是两个基因往往会转 录干扰和/或不同水平的表达，有时报告基因表达了但插入的目的基因不一定表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组表达载体，该载体可同时表达两个蛋白，这两个 蛋白可形成活性形式的caspase-3，进而激活细胞凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋 亡。本专利技术提供了转录融合双基因片段K，自上游至下游依次为caspase-3 P17亚 基基因序列、IRES序列和caspase-3 P12亚基基因序列。所述caspase-3 P17亚基基因序列是如下1)或2)或3)的DNA分子1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3) 与序列表中序列1限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。所述IRES序列是如下4)或5)或6)的DNA分子4) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；5) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；6) 与序列表中序列3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。所述caspase-3 P12亚基基因序列是如下7)或8)或9)的DNA分子7) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；8) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；9) 与序列表中序列2限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC， 0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用2X SSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。含有上述任一所述基因片段K的表达盒或重组表达载体均属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体为真核表达载体。所述载体中还可包含PBR322复制起点和/或氨苄青霉素抗性基因。 所述重组表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建，如可按照如下方法构 建PCRC:所述PCRC是将IRES序列插入质粒PC1的caspase-3 P17亚基基因序列和 caspase-3 P12亚基基因序列间得到的；所述质粒PC1是将pcDNA3. 1 (-)的Jfel和^adH位点间的小片段取代为 caspase-3 P17和caspase-3 P12亚基基因序列得到的。含有上述任一所述基因片段K的细胞系或重组菌也都属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体、表达盒、细胞系和重组菌均可应用于制备诱导癌细胞凋亡 的药物或抗癌药物。本专利技术通过IRES将caspase-3 P17亚基基因和caspase-3 P12亚基基因融合 形成转录融合双基因，将该转录融合双基因插入真核表达载体得到的重组表达载体 可以在转染细胞中高效地表达活性形式的caspase-3，从而激活细胞凋亡信号通路， 促进细胞凋亡。将本专利技术的重组表达载体转入癌细胞，可以有效地诱导肿瘤细胞的 凋亡，为基因治疗提供新的手段。本专利技术的重组表达载体可以用于制备诱导癌细胞 凋亡的药物或抗癌药物。本专利技术将在生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作 用，应用前景广阔。以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。 附图说明图1为针对PARP的western blot图具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W. ， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。实施例l、载体PCRC的构建一、 caspase-3全基因序列的克隆根据文献调研，人慢性粒细胞白血病细胞株K562中caspase-3表达量远高于 其他癌细胞。根据GeneBank中公布的caspase-3全基因序列以及它的上下游序列， 设计一对PCR引物PI和P2。以K562细胞的cDNA为模板克隆caspase-3。PI: 5， -ACCTGTGGCTGTGTATCCG-3，；P2: 5， -ATGCCCACAGATGCCTAAG-3，。PCR反应体系为19uLddH20， 5ixLDMS0， 10u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5wLPl (4um/uL) ， 5 n L P2 (4 u m/u L) ， 2 u L K562 cDNA (Ing/tiU ， 0. 5tiL Primerstar。PCR反应条件为98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 l分20秒，共40个循环。反应产物记做C1，对(]1进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，获得了 1400bp的DNA片段，与预期结果相符。根据CI的序列设计一对PCR引物P3和P4。以CI为模板进行PCR。P3: 5' -AACGGATCCATGGAGAACACTGAAAACTCAG-3，；P4: 5' - GTCGAATTCTTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTG-3，。PCR反应体系为:20uLddH20， 5uLDMS0， 10u L 5XPrimerstar buffer(含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5 u L P3 (4 y m/u L) ， 5 u L P4 (4 y m/y L) ， luLCl， 0.5 u L Primerstar。PCR反应条件为98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 50秒，共35个循环。反应产物记做C2，对C2进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，获得了 800bp 的DNA片段，C2即为caspase-3的全基因序列。二、 ca印ase-3 P17亚基和P12亚基的克隆 1、 caspase-3 P17亚基的克隆设计一对引物P5和P6，并在序列两端分别添加限制性内切酶JZ^I和尸I识别位点。P5中带下划线碱基为限制性内切酶Ztel识别位点，P6中带下划线碱基为 限制性内切酶尸WI识别位点。以C2为模板进行PCR。P5: 5' - GAATCTAGAGCCACCATGTCAGGCTCTGGAATATCCCTGGACAAC-3，;P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转录融合双基因片段Ｋ，自上游至下游依次为ｃａｓｐａｓｅ－３Ｐ１７亚基基因序列、ＩＲＥＳ序列和ｃａｓｐａｓｅ－３Ｐ１２亚基基因序列。

【技术特征摘要】
1、一种转录融合双基因片段K，自上游至下游依次为caspase-3P17亚基基因序列、IRES序列和caspase-3P12亚基基因序列。2、 如权利要求1所述的基因片段K，其特征在于所述caspase-3P17亚基基因 序列是如下l)或2)或3)的DNA分子1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3) 与序列表中序列l限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。3、 如权利要求1或2所述的基因片段K，其特征在于所述IRES序列是如下4) 或5)或6)的DNA分子4) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；5) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；6) 与序列表中序列3限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。4、 如权利要求3所述的基因片段K，其特征在于所述caspase-3 P12亚基基因 序列是如下7)或8)或9)的DNA分子7) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；8) 在严格条件下与l)限...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宇扬，谢振华，董爱君，刘华臣，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]