一种根瘤菌科的基因及多肽和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种根瘤菌科的基因及多肽和应用。所述根瘤菌科的基因具有如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ?２所示ＤＮＡ序列；所述多肽基因具有如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ?３所示核苷酸序列和ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ?４所示氨基酸序列。本发明专利技术采用乙炔还原法、总氮含量测定（凯氏定氮法）和１５Ｎ２同位素标记方法进行检验和确定，证实所述多肽具有固氮酶活性，能够将空气中的Ｎ２固定，还原为ＮＨ４＋，可作为生物固氮的新技术应用于工、农业生产。

Gene, polypeptide and application of Rhizobium

The invention discloses a gene and a polypeptide of Rhizobium and an application thereof. The Rhizobiaceae gene has such as SEQ? ID? NO? 2 DNA sequence shown; the polypeptide gene has such as SEQ? ID? NO? 3 in nucleotide sequence and SEQ? ID? NO? 4 amino acid sequence shown. The invention adopts the determination of total nitrogen, acetylene reduction method (Kjeldahl method) and 15N2 isotope labeling method to test and determine that the polypeptide has nitrogenase activity, can be in the air N2, reduced to NH4 +, can be used as the application of new technology of biological nitrogen fixation in industrial and agricultural production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物固氮
，具体涉及一种根瘤菌科的基因，以及具有所述基 因序列的多肽，所述基因与多肽在生物固氮方面的应用。
技术介绍
化学氮肥的制造是一个高耗能的过程，而生物固氮可以在常温常压下利用固氮酶 将空气中的氮气固定成氨，作为生命体系的氮素来源，既节省能源，又对环境友好。生物固 氮体系本身就是一座小化肥厂，原料来自空气，取之不尽。在当前能源日益紧张和环境日益 恶化的情况下，随着生物技术的发展和研究方法的进步，克隆生物固氮的相关的酶和它编 码的基因，进行遗传工程操作，使固氮酶基因在原核生物和植物组织内表达，为节约能源、 改善环境和促进农业生产应用。生物固氮所涉及的固氮菌有三种类型，第一类是自生固氮菌，如蓝细菌；第二类是 联合固氮菌，如植物体内的内生固氮菌，巴西在甘蔗生产中使用联合固氮体系，可为甘蔗提 供60%的氮素来源；第三类是共生固氮菌。共生固氮现象从1887年发现至今已经有120多年，世界各国的科学家花费了大量 的时间和精力对它进行研究，目前取得了不少进展，加深了我们对生物固氮的认识和理解。 共生固氮菌的固氮效率高，但仅局限于豆科等少数植物。且共生固氮菌的共生基因、结瘤基 因、固氮基因和植物-根瘤菌的信号识别基因调控关系复杂。传统的固氮酶基因家族大多是多个基因相互作用共同完成固氮过程，单个基因编 码的多肽通常不能够独立进行固氮。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种根瘤菌科的基因。本专利技术的另一个目的是提供具有上述根瘤菌科编码基因的新的具固氮功能的多 肽。本专利技术还有一个目的是提供所述基因和多肽的应用。所述新的固氮多肽及其编码 的基因来源于原核生物根瘤菌科，不同于传统的固氮酶基因家族有多个基因相互作用共同 完成固氮过程，单个基因编码的多肽能够独立进行固氮。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现提供一种根瘤菌科的基因，具有SEQ ID NO 2所示序列。所述根瘤菌科的基因的扩增方法是(1)基因片段扩增设计正向引物和反向引物正向引物HnifF，5'-TGA CCC CAA GGC CGA CC-3'；反向引物HnifR，5' -GTG CCA TCA TCT CGC C_3'。对根瘤菌科的菌株进行PCR扩增，获得了约1. 4kb的序列SEQ ID N01。(2)使用反向PCR (inverted PCR)技术扩增根瘤菌科的菌株Ag 39序列SEQ ID NO 1片段两端的序列获得约3. 3kb的序列SEQ ID NO 2 ；(3)对序列SEQ ID NO 2进行生物信息学分析，获得该基因的阅读框架核苷酸序列 SEQ ID NO 3 ；同时获得了该基因的氨基酸序列SEQ ID NO 4 ；(4)设计正向引物和反向引物，从根瘤菌中扩增SEQ ID NO 3所示基因；正向引物0rfF，5'-ATCG AAT TCCTC TCC TCG GTC GAT CGCCCA-3 ‘(含 EcoRI 酶切位点)；反向引物0rfR，5'-GCCA AGC TTCA TCC GTG TCC GTC CTTTCT G_3'(含 Hind III酶切位点)。本专利技术同时提供了一种新型多肽基因，将上述步骤⑷的PCR产物酶切后，克隆到 原核表达载体pET-32a-c (+)中，获得转化子，编号3_4，采用异丙基-口 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导，获得了所述固氮多肽的表达，具有SEQ ID N03所示核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。采用乙炔还原法、总氮含量测定(凯氏定氮法)和15N2同位素标记方 法进行检验和确定，证实所述多肽能够固氮。本专利技术提供了所述基因和多肽在生物固氮方面的应用。本专利技术的有益效果是本专利技术提供了一种新的根瘤菌科的基因及具固氮功能的新型多肽，所述多肽不同 于传统的固氮酶基因家族需要多个基因相互作用共同完成固氮过程，所述单个基因编码的 多肽能够独立进行固氮，并可以在常温常压下利用固氮酶将空气中的氮气固定成氨，作为 生命体系的氮素来源，既节省能源，又对环境友好。附图说明图1本专利技术多肽电泳2对照样将乙炔还原为乙烯的气相色谱仪测定结果图3样品3-4将乙炔还原为乙烯的气相色谱仪测定结果具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。实施例11.新型多肽基因的获得(1)基因片段扩增设计正向引物和反向引物正向引物HnifF，5'-TGA CCC CAA GGC CGA CC-3'；反向引物HnifR，5'-GTG CCA TCA TCT CGC C-3'。本专利技术人从内蒙古响水湾沙漠中的Psammochloa villosa植物中分离到的一株固 氮菌，采用常规的苯酚_氯仿抽提方法提取总DNA，乙醇沉淀和洗涤，所用试剂为常规的分 子生物学试剂，对根瘤菌科的菌株的基因组进行PCR扩增。PCR反应体系10XPCR Buffer2. 5 u LdNTPmix (2. 5mmol. I71)0. 5 u LHnifF(25uM)0. 5 u LHnifR(25uM)0. 5 u LDNA 模板0. 5 ii LTaq 酶(4U/ u L)0. 5 u Ldd H2020 u L_反应总体积25iiLPCR反应条件(32个循环)94°C 预变性4min94°C 变性 lmin60°C 复性 45s72°C 延伸 lmin30s72°C 延伸 lOmin电泳检测，获得了约1. Okb的序列SEQ ID NO 1。(2)使用反向PCRGnverted PCR)技术扩增上述序列的侧翼序列根瘤菌科的菌株 Ag39基因组DNA的酶切将基因组DNA分别用4种常用的限制性内切酶(EC0RI、HindIII、BamHI、PStI)进行酶切反应，酶切体系基因组DNA约 300ng限制性内切酶酶2iiL限制性内切酶buffer5u L10% BSA0. 2u L灭菌的超纯水适量_总体积50iiL取5 u L进行核酸电泳检测酶切是否完全，各酶切产物纯化后，加入T4DNA liagase 分别进行DNA的自身环化。在酶切体系中加入4. 5 ii L的乙酸钠(pH = 5. 2)及150 y L的 无水乙醇沉淀，12000rpm，离心lOmin，用70 %乙醇漂洗，真空干燥，复溶于38 y L无菌水中待连接。(3)酶切产物自身环化(连接反应)连接体系10 XT4 连接 buffer 2. 5 u LT4DNA 连接酶1 P L酶切纯化产物12iiL_灭菌的超纯水to 20 U L12°C保温16h，此基因组自身环化产物作为反向PCR模板。(4)反向PCR反应根据已知的IOOObp基因序列，设计引物HniHcF和HniHcR，序列分别为HniHcF 5' CAAGGCGAGATGATGGC-3‘ HniHcR 5' -CGTTGGTCGGCCTTGGG-3‘以基因组DNA自身环化的产物作为反向PCR反应的模板进行反向PCR扩增。反应体系PCR反应体系10XPCR Buffer2. 5 μ LdNTP mix (2. 5mmol. L-1) 0. 5 μ LHniHcF (25 μ Μ)0. 5 μ LHniHcR(25yM)0. 5 μ LDNA模板(连接产物)2 μ LTaq 酶(4U μ Γ1)0. 5 μ Ldd本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种根瘤菌科的基因，其特征在于具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２所示序列。

【技术特征摘要】
一种根瘤菌科的基因，其特征在于具有SEQ ID NO 2所示序列。2.—种权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于是设计正向引物和反向引物，通 过PCR方法进行固氮基因的扩增得到。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述正向引物和反向引物为 正向引物:Hnif F，5' -TGA CCC CAA GGC CGA CC_3'；反向引物:Hnif R，5' -GTG CCA TCA TCT CGC C_3'。4.一种多肽基因，其特征在于具有SEQ ID NO 3所示序列。5.一种权利要求4所述多肽基因的获取方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭志远，何玉梅，彭桂香，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]