一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法。将来自水稻的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（ＯｓＵｇｐ２）连接到过量表达载体中，通过农杆菌介导法将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因转入灵芝中，获得的转基因灵芝菌株中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达增强，紫芝的生物量、胞内多糖和胞外多糖的含量均得到明显的提高。本发明专利技术能有效提高灵芝等食用和药用真菌中生物产量和多糖含量，为提高食用和药用真菌多糖含量提供了一条新的途径，具有良好的应用和开发前景。

Method for improving biological yield and polysaccharide content of Ganoderma lucidum

The invention discloses a method for improving the biological yield and polysaccharide content of Ganoderma lucidum. Uridine two phosphate glucose pyrophosphorylase gene from rice (OsUgp2) connected to the over expression vector, the uridine two phosphate glucose pyrophosphorylase gene in Ganoderma lucidum by Agrobacterium mediated method. Transgenic Ganoderma strains were obtained, enhanced expression of uridine two phosphate glucose pyrophosphorylase gene, the polysaccharide content of biomass Rosie, intracellular and extracellular polysaccharides were improved obviously. The invention can effectively improve the biological output and polysaccharide content of edible fungi and medicinal fungi such as Ganoderma lucidum, and provides a new approach for improving the content of edible fungi and medicinal fungi polysaccharide, and has good application and development prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因食用真菌
具体涉及一种通过转基因技术将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因转入食用真菌灵芝中过量表达，从而提高灵芝生物产量和多糖含量的方法。
技术介绍
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase, UGPase, EC 2. 7. 7. 9)是生物体内的一种重要酶类，与糖类代谢过程密切相关。UGPase可催化一依赖镁的可逆反应，反应式如下UTP+G-1-P—— UDPG+PPi。尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作为葡萄糖基的供体，参与蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多种碳水化合物的合成代谢(KleCZkOWSki，1994)。至今有关UGPase过量表达的研究不多，有研究表明提高黄芪毛状根中UGPase的活性，可提高黄芪多糖的含量。黄芪总多糖积累量和UGPase活性之间呈正相关，两者的相关系数达到0. 928，可溶性多糖与UGPase活性的相关系数则达到0. 957(吴晓俊，刘涤， 胡之璧.黄芪毛状根中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性与多糖含量关系的研究，上海中医药大学学报，2000，14 ) 53-55) ；UGPase在烟草、杨树中的过量表达显示相应的转基因生物可溶性糖含量增加，木质素、纤维素含量及整体生物量有不同程度的增加(Coleman HD, Ellis DD, Gilbert Μ, et al. Up—regulation ofsucrose synthase and UDP-glucose pyrophosphorylase impacts plant growthand metabolism. Plant Biotechnology Journal，2006，4 :87-101) ；UGPase在水稻中的过量表达可以使水稻结实粒数和单株粒重等产量性状得到明显改善(公开号CN 1614023A的专利技术专利申请)；也有报道在大肠杆菌中过量表达低聚糖合成途径中两个关键的酶UGPase和葡萄糖磷酸变位酶基因，使 UDPG的合成量提高，从而提高了低聚糖的含量(Mao Z. Shin HDand Chen RR. Engineering the Ε.coli UDP-glucose synthesis pathway foroligosaccharide synthesis. Biotechnology Progress,2006,22(2) :369-74)。但是，UGPase在真菌中的过量表达未见相关技术报道。因真菌生长和菌丝结构的特殊性，上述现有的UGPase过量表达技术在真菌中没有更多的可复制和参比性。灵芝是重要的药用真菌，灵芝多糖含量是灵芝的主要药用成分之一，灵芝多糖作为灵芝中最主要的药用成分，药理活性广泛，具有提高机体免疫功能、抗肿瘤、消除机体内自由基延缓衰老、抗辐射、提高肝脏解毒功能等作用，是决定灵芝品质的重要因素。而目前国内外在提高灵芝多糖产量方面的研究大多集中在菌种诱变选育和发酵条件的优化方面 (李刚，杨凡，李瑞雪等.原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究.微生物学报，2001， 41 (2) :229-233;孙金旭，朱会霞.生长因子对灵芝生长及多糖产量的影响.中国酿造， 2008，24:69-71)，这些方法也都在一定的程度上提高了灵芝多糖的含量。目前为止，根据代谢工程的原理，利用基因工程来改造菌株，从而提高多糖含量的方法尚未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，通过转基因技术将多糖合成相关功能基因转入灵芝真菌中，获得灵芝多糖含量稳定提高的转基因灵芝菌株。本专利技术的技术方案是通过大量实验筛选对比研究，将从水稻中克隆的与多糖代谢相关的关键酶基因-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(Oryza sativa UDP-glucose pyrophosphorylase 2，0sUgp2, GenBank 登录号为 AF249880)与构巢曲霉(Aspergillus nidulans) 3_ 舞酸甘油Ig月兑S1S!基因(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase, gpd) 的启动子连接，构建了过量表达载体，命名为OsU-gpd。所述载体具有完整的左右边界序列， 选择标记基因为潮霉素抗性基因，适合农杆菌介导法转化灵芝。本专利技术进一步通过农杆菌介导法将表达载体OsU-gpd转入灵芝，得到具有潮霉素抗性的转化菌株。并对转化菌株进行了 PCR(聚合酶链反应)、Southern杂交分析、 RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)、表达产物UGPase酶活性检测等的一系列鉴定，证明获得的转化菌株外源基因0sUgp2成功插入受体灵芝基因组中，并成功表达，有效提高灵芝的生物产量和多糖含量。本专利技术的有益效果是本专利技术通过转基因技术将多糖合成相关功能UGPase基因转到紫芝菌株中去，获得多糖含量明显提高的转基因灵芝，为提高灵芝多糖含量，培养灵芝新菌株开辟一条新的途径。采用苯酚-硫酸法分别测定发酵第7天的紫芝菌丝体的胞内多糖含量、胞外多糖含量及菌丝体干重。实验结果表明第一代转化菌株的多糖平均含量为9. 56mg/g菌粉，比野生型对照菌株提高了 12. 3% ；胞外多糖含量为82. 52mg/L与对照野生型菌株相比提高了 22.96%。此外，转化菌株的生物量也得到增加，第一代转化菌株的菌丝体干重平均达到 6. 45g/L，比对照菌株提高了 7. 7%。采用SPSS13. 0数据统计分析软件分析了 UGPase酶活力与多糖含量之间的相关性，结果表明紫芝菌丝体的总糖含量，胞内多糖含量和胞外多糖含量与UGPase的酶活力都显示了较强的相关性，其相关系数分别为0. 826，0. 980和0. 815。 其中胞内多糖含量与UGPase酶活力的相关性最高达0. 98，说明了 UGPase主要参与了胞内多糖的合成。本专利技术得到的转0sUgp2的转基因紫芝菌株，紫芝的多糖含量和生物量均得到明显提高，为提高食用和药用真菌多糖含量提供了新的实用技术和趋势，具有良好的应用和开发前景。附图说明图1 0sUgp2过量表达载体OsU-gpd T-DNA区示意图图2转化紫芝菌丝体在含有20 μ g/mL潮霉素(Hyg)的MYG培养基平板上生长1 周的情况图3转基因紫芝的PCR鉴定图4转基因紫芝的Southern杂交分析图5 RT-PCR分析转基因菌株外源基因0sUgp2的表达具体实施方式本专利技术方法适用于赤芝(G. Iucidunz)、紫芝(G. sinense)、松杉灵芝(G. tsugae)或树舌(G. applenatum)等灵芝，实验步骤大致相同。下面以紫芝为例，结合附图和具体实施过程进一步详细说明本专利技术，其它种类的灵芝不一一在实施例中赘述，但并不因此限定本专利技术范围。实施例1 农杆菌介导法转化紫芝(1)农杆菌介导的灵芝过量表达载体OsU-gdp的构建本实施例转化载体可选用通过农杆菌介导的常规二元表达载体，在T-DNA两边界间，插入真菌中表达的启动子(本实施例中为gpd启动子)，再加上本专利技术所述的目的基因 (尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)，及选择性标记基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法，其特征在于采用真菌表达启动子驱动尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在灵芝中过量表达，提高灵芝生物产量、胞内和胞外多糖含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：穆虹，张帆，钟威，李刚，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]