一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法技术

本发明专利技术公开了一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法，包括如下步骤：慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；然后经人工授精雌性动物，在子代动物筛选转基因猪。本发明专利技术采用慢病毒与精子共孵育的技术，通过精子吸附慢病毒后再人工授精或体外受精，将慢病毒导入受精卵中，并将外源基因整合到胚胎基因组中，从而制备转基因猪。从而克服了精子吸附裸ＤＮＡ介导转基因猪整合率非常低、遗传不稳定等问题。该方法的突出特点是结合了慢病毒与精子载体的各自优点，操作简便、成本较低。利用慢病毒载体与精子孵育，是一种低成本、操作简便、转基因效率较高的转基因方法。

Method for preparing transgenic pig by incubation of slow virus and sperm

The invention discloses a method for slow virus and preparation of transgenic pig sperm incubation, which comprises the following steps: lentiviral vectors were incubated with sperm, the sperm adsorption of lentiviral vector; then the artificial insemination of female offspring in animal, animal screening of transgenic pigs. The invention adopts the lentivirus and sperm incubated sperm through technology, absorb the slow viruses and then artificial insemination or in vitro fertilization, lentivirus into fertilized egg, and the exogenous gene integrated into the embryonic genome, thereby preparing transgenic pigs. Thus, the problem of low rate of integration and genetic instability of transgenic pigs with sperm absorption by naked DNA was overcome. The prominent feature of this method is that it combines the advantages of lentivirus and sperm carrier, and it is easy to operate and low in cost. Incubation of spermatozoa with lentiviral vectors is a low cost, simple and highly efficient transgenic method.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备转基因猪的新技术。
技术介绍
精子介导基因转移方法是目前获得转基因猪简单而高效的方法之一。该方 法在小鼠、猪等动物上有过成功的报道，但随后的研究中，由于转基因的效 率低而一度引起争议，且不同的实验室报道的结果差异很大，存在外源基因 整合效率差的问题。慢病毒被认为是制备转基因猪的新型优良基因转移载体。慢病毒即能感染 分裂细胞又能感染非分裂细胞，可从生殖细胞到囊胚期各发育阶段转移外源 基因。目前利用慢病毒载体感染动物胚胎、受精卵以及精原干细胞成功了生 产转基因鼠、羊、牛、猪、鸡、鱼等动物。大量研究证实精子和慢病毒是基因转移的理想载体，但是有关慢病毒和精 子共孵育制备转基因猪的研究国内外未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了。 ，包括如下步骤慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；然后经人工授精雌性动物，在子代动物筛选转基因猪。，包括如下步骤慢病毒载体 与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；经体外受精，体外培养后胚胎移植， 获得转基因猪。在上述慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法中，所述慢病毒与精子共孵 育的方法为动物精液稀释液洗去精清，取洗去精清的精子于人工授精瓶中，加入慢病毒液，盖紧放于17。C保温箱120min，其间每15min轻轻翻动精液瓶， 防止精子沉淀聚集，送配种前10min检验活力，其活力达到0.5以上可进行人 工受精。在上述慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法中，所述人工授精的方法 为选健康雌性动物，于发情当天肌注人类绒毛性腺激素，肌注后进行人工输 精。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术采用慢病毒与精子共孵育的技术，通过精子吸附慢病毒后再人工授 精或体外受精，将慢病毒导入受精卵中，并将外源基因整合到胚胎基因组中，从而制备转基因猪。从而克服了精子吸附裸DNA介导转基因猪整合率非常低、 遗传不稳定等问题。该方法的突出特点是结合了慢病毒与精子载体的各自优 点，操作简便、成本较低。利用慢病毒载体与精子孵育，是一种低成本、操作 简便、转基因效率较高的转基因方法。附图说明图1为转基因仔猪eGFP荧光观察图。图2为人工授精PCR检测转基因仔猪电泳图。 l-8为仔猪样品；除3号外，其它均能检测到基因的存在。图3为人工授精PCR检测阳性转基因仔猪的Southern blot结果图。Control为 已知阳性结果，阳为阳性仔猪杂交结果。具体实施例方式实施例1慢病毒载体包装用293T包装细胞制备慢病毒载体。在质粒DNA共转染293T细胞前24h， 消化传代293T细胞，接种6xl06个细胞。质粒转染前2 3h，更换细胞培养基， 添加新鲜培养基。根据质粒DNA的浓度以及转染细胞的数量计算出每种质粒 的需要量(包装质粒6125/ig、转移质粒6125/ig和外膜质粒2150/ig)。培养 8h后，更换新鲜培养基。分别在转染后的第l、第2和第3天采取完全更换 新鲜培养液和不更换培养液两种方式收集制备病毒载体,并测定载体滴度。收 获不同批次制备的病毒载体，采用大量制备试剂盒过滤后，高速梯度离心收集， 于-8(TC保存备用。实施例2转基因猪的制备1、猪精子与慢病毒载体的共孵育猪精液稀释液(Swine Fertilization Medium, SFM)的配制11.25g无水 葡萄糖10g二水柠檬酸三钠4.7g二水乙二胺四乙酸二钠3.25g—水柠檬 酸6.5g三羟甲基氨基甲烷加双蒸水定容1升，最后加入6g牛血清白蛋白 (BSA)，现配现用。(1)确定与配公猪，检验精液品质，最近三次记录合格目活力达到0.7以上。选择试验当天所采长白猪精液中精子活力最高的那份精液，收集精液中浓稠的部分5mL到15mL离心管中，加入当天配制好并预热的SFM/BSA液 5mL (注意两者之间温差一定要小于1°C)。室温放置5min。(2) 将上述精液转移至装有40ml SFM/BSA的50ml离心管中，25°C， 800g离心10min小心吸去上清，加40ml SFM/BSA (25°C )精子稀释液于17°C ■g离心10min小心吸去上清，加入3-4ml SFM/BSA (17°C)轻轻吹打，使 精子重悬。(3) 检测精子活力，并计数，如精子活力达到0.65以上，即可取109 个精子于40ml SFM/BSA (17°C)的人工授精瓶中，加入50ug DNA ，吸去 泡沫，盖紧放于17C保温箱lOOmin，其间每15min轻轻翻动精液瓶，防止精 子沉淀聚集，送配种前lOmin检验活力，其活力达到0.5以上可进行人工受 精。2、转基因猪的制备(1) 人工授精于发情当天肌注人类绒毛性腺激素(HCG)。肌注HCG24 h后，进行人工输精，每侧lmL(约含精子5x107个/mL)。分娩后，用PCR、 Southern blot鉴定转基因阳性仔猪。PCR结果见图2， Southern blot结果见图3 。 PCR法是一种快速简洁的鉴定方法，由于存在一定的假阳性，用于初步阳性 仔猪的检测。Southern blot是一种经典的阳性鉴定方法，准确率高，用于进一 步的阳性检测，两者结果结合说明转基因获得了成功。(2) 体外受精:将体外培养42—44h的卵丘细胞与卵母细胞复合体(COCs) 取出，脱卵丘细胞之后，用TRIS缓冲培养液(mTBM)洗涤3遍；每个 50AtLmTBM液滴中放置25个成熟的卵母细胞；在培养箱中培养30—45min之后，每个液滴中添加此前处理好的精液，同时添加高滴度的慢病毒载体;将精子、卵母细胞和高滴度慢病毒载体混合液在培养箱中，39°C， 5%(^02的 空气，饱和湿度培养7h;将可能的受精卵用胚胎培养液洗涤3遍后，按照20-25 个胚/50/zL， 39°C， 5XC02的空气，饱和湿度培养；分别在2d和7d计算卵裂 率和囊胚率以及阳性胚胎率。采用输卵管移植，分娩后，用直接观察荧光、PCR、 Southern blot鉴定转基因阳性仔猪。荧光结果见图1 ， PCR结果见图2， Southern blot的结果见图3。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法，其特征在于包括如下步骤：慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；然后经人工授精雌性动物，在子代猪中筛选转基因动物。

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法，其特征在于包括如下步骤慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；然后经人工授精雌性动物，在子代猪中筛选转基因动物。2. —种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法，其特征在于包括如下步 骤慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；经体外受精，体外 培养后胚胎移植，获得转基因猪。3. 如权利要求1或2所述的制备转基因猪的方法，其特征在于所述慢病...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永亮，习欠云，丁景华，吴珍芳，蔡伟光，张守全，江青艳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[]