用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于：所述滴眼液包括Ｎｏｇｏ６６蛋白和壳聚糖，其中Ｎｏｇｏ６６蛋白与壳聚糖的体积比为１∶１，Ｎｏｇｏ６６蛋白的浓度为０．１－１．５ｍｇ／ｍｌ，壳聚糖的浓度为１－１５ｍｇ／ｍｌ。本发明专利技术所述疫苗滴眼液用于青光眼所致的视网膜神经节细胞凋亡或外伤引起的视神经损伤，能有效地改善受损神经元的微环境，促使神经元的修复与再生，使用安全，并且具有价格低廉，接种方便的优点。

Vaccine eye drops for treating and preventing glaucoma and preparation method thereof

The invention relates to a vaccine for the eye drops in the treatment and prevention of glaucoma, which is characterized in that the eye drops including Nogo66 protein and chitosan, which Nogo66 protein and chitosan, the volume ratio of 1: 1, the concentration of Nogo66 protein was 0.1 1.5mg / ml, the concentration of chitosan was 115mg / ml. The invention of the vaccine, eye drops for glaucoma optic nerve injury induced apoptosis of retinal ganglion cells or trauma, can effectively improve the microenvironment of damaged neurons, promote the repair and regeneration of neurons, the use of safety, and has advantages of low price, convenient inoculation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种疫苗，特别涉及一种。
技术介绍
青光眼是世界上第二大致盲性疾病，可引起不可逆的视网膜神经节细胞(Retinalganglion cells RGCs)凋亡和视神经萎縮，最终导致失明。视神经损伤也是临床常见的外伤类型和致盲原因，其它眼部多种疾病如视神经炎，缺血性视神经病变、视网膜血管阻塞、视网膜变性性疾病均可累及视神经导致视神经萎縮最终失明。目前青光眼的主要治疗手段是用药物或手术降低眼压；然而，即使去除高眼压等诱因，视网膜神经节细胞的丢失和视神经萎縮仍然继续，常规的降眼压治疗无法阻止或预防这种继发性的损害。研究发现，高眼压和视神经损伤后神经元缺乏轴突远端及神经元局部营养因子的支持导致视网膜神经节细胞的进行性丢失及其神经纤维的变性。大量的研究证实给予外源性的神经营养因子如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，胶质细胞源性神经营养因子(glialcelline-derived neurotrophic factor, GDNF)睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophic factor, CNTF)可有效的促进损伤后视网膜节细胞的存活和轴突生长，但时间较短。通过眼内注射的方法易引起眼部感染，对青光眼及其它视网膜变性性疾病不是终生用药的途径。 Bakalash(2003)应用感光细胞间维生素A类结合蛋白(interphotorec印torretinoid-binding protein, IRBP)对高眼压大鼠进行眼内接种后发现，视网膜神经节细胞的高眼压性损伤得到遏制。故Bakalash认为，对于神经变性损伤而言，损伤部位内源性抗原激活特异性T淋巴细胞介导的神经免疫保护是有效的治疗策略。 研究发现，视网膜神经节细胞受损后存活或再生困难的一个主要原因是由于髓磷脂蛋白的存在，抑制因子Nogo是其中重要成员之一，Nogo在正常中枢神经系统(centralnervous system, CNS)、视神经及视网膜少量表达。中枢神经受损后Nogo因子释放增加、表达增强，不仅抑制神经纤维再生，而且可启动神经元凋亡过程，导致神经元死亡。Schwab等制备出Nogo的单克隆抗体IN-1 ，并进行大量在体试验，证实IN-1可促进脊髓和脑损伤后轴突长距离的再生长。Liebscher等切断2_6周龄大鼠皮质脊髓束后将IN_1单抗杂交瘤细胞移入脑内，在损伤处见到神经轴突明显的侧向发芽生长。Hauben等用髓磷脂抗原或被动转移髓磷脂活化T细胞均可减少外伤性脊髓和视神经损伤引起的神经退化，并提高功能恢复。众多研究表明，主动免疫或被动免疫阻遏Nogo或髓磷脂均能够促进CNS再生。视神经是CNS的一部分，相同的手段是否也能促进视神经损伤后的再生呢？ Nogo有66个氨基酸残基在胞膜外形成拓扑结构，即Nogo66，是Nogo的活性区域，介导了 Nogo的神经抑制活性。我们在前期利用基因重组技术原核表达和纯化了 Nogo66蛋白，并制备成Nogo66福氏佐剂疫苗，接种于慢性高眼压大鼠四肢躯干皮下，可诱导大鼠机体产生特异性IgG抗体和T淋巴细胞增殖，并证实对慢性高眼压大鼠RGCs的数量和功能有一定保护作用。 青光眼是一种需要终身治疗的疾病，而Nogo66蛋白疫苗通过传统途径接种后产生的免疫效应持续时间较短，需要不断加强免疫才能维持一定的抗体滴度和活化T细胞数量，患者必须经常到医院就诊接受皮下注射接种疫苗，对于行动不便或边远地区的患者，以及不太理解注射疫苗意义的患者，很难做到按时到医院就诊，难以维持有效的免疫效应，不能达到应有的治疗效果。另外，Nogo66是一个分子量为7. 53461kD的小分子蛋白，小剂量皮下接种很难完全激活机体免疫系统，在眼球视网膜这样的免疫特赦器官获得较好的免疫效应。如果增加剂量，则有致实验性自身免疫性脑脊髓炎(e邓erimentalautoimmuneenc印halomyelitis， EAE)的风险。因此，通过眼局部结膜淋巴途径或角膜途径直接接种，可减少疫苗中蛋白的使用剂量，提高局部免疫能力，并且患者可以将疫苗拿回家，按照医嘱自行点眼接种，使用方便等优点。不仅可治疗青光眼，主动保护受损的RGCs，减少其凋亡，增加其数量，对青光眼的进一步发展也起到预防的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于治疗和预防青光眼视网膜视神经损伤的疫苗滴眼液及制备方法，本专利技术所述疫苗滴眼液用于青光眼所致的视网膜神经节细胞凋亡或外伤引起的视神经损伤，能有效地提高视网膜视神经自身免疫保护能力改善受损神经元的微环境，促使神经元的修复与再生，使用安全，并且具有价格低廉，接种方便的优点。 本专利技术的技术方案是 用于青光眼的疫苗滴眼液，包括Nogo66蛋白和壳聚糖，其中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1:1， Nogo66蛋白的浓度为0. 1-1. 5mg/ml，壳聚糖的浓度为H5mg/ml。 较好的技术方案是所述滴眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1 : 1，Nogo66蛋白的浓度为1-1. 5mg/ml，壳聚糖的浓度为10-15mg/ml。 最好的技术方案是所述滴眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1 : 1，Nogo66蛋白的浓度为lmg/ml，壳聚糖的浓度为10mg/ml。 所述疫苗中壳聚糖包裹Nogo66蛋白。 制备用于青光眼的疫苗滴眼液的方法，其特征在于有以下步骤 1)取Nogo66蛋白溶液加入双蒸水配成0. 1-1. 5mg/mlNogo66蛋白； 2)取壳聚糖，加入双蒸水，滴加醋酸，使其胶溶，配制l-15mg/ml壳聚糖溶液； 3)步骤1) 、2)所得溶液分别过滤3-5次，除菌； 4)将步骤3)所得的两溶液等体积混合，充分搅匀； 5)将步骤4)所得溶液中滴加1.0mol/L氢氧化钠，调整其ra值为6. 0-8. 0，即用于青光眼的疫苗滴眼液。 步骤3)中所述的过滤，采用0. 22 ii m无菌微孔滤器过滤。 我们在前期实验中纯化表达了 Nogo66蛋白，检验其N末端氨基酸序列证实为目的蛋白，并检测了蛋白浓度、纯度，均达到了制备疫苗的标准。并应用ProPred web interface程序，ProPred MHC Class-II Binding P印tidePrediction Server抗原表位分析软件进行Nogo-66抗原表位分析，证明Nogo-66有明确的T淋巴细胞抗原表位，能够被抗原提呈细胞识别，引起Nogo-66抗原特异性T淋巴细胞活化。证明了重组Nogo-66蛋白具有免疫原性，能够提高中枢神经系统和视网膜T淋巴细胞介导的免疫保护反应，达到对受损的RGC或神经元的保护作用。 在此基础上，我们制备了 Nogo66蛋白-壳聚糖疫苗滴眼液(Nogo66-CS疫苗滴眼液)并考察其ra值、渗透压等一般性质，在确定其符合眼用制剂药物的标准后，于正常实验动物进行了眼剌激性试验和毒性试验，证明其安全性。给予实验动物Nogo66-CS疫苗滴眼液试验性点眼，发现其可激活实验动物粘膜免疫系统和视网膜小胶质细胞活化；并行Nogo66-CS疫苗滴眼液体外剌激培养小胶质细胞，发现亦可使其活化，证实Nogo66-CS疫苗滴眼液具有免疫原性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于：所述滴眼液包括Ｎｏｇｏ６６蛋白和壳聚糖，其中Ｎｏｇｏ６６蛋白与壳聚糖的体积比为１∶１，Ｎｏｇｏ６６蛋白的浓度为０．１－１．５ｍｇ／ｍｌ，壳聚糖的浓度为１－１５ｍｇ／ｍｌ。

【技术特征摘要】
一种用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液包括Nogo66蛋白和壳聚糖，其中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1∶1，Nogo66蛋白的浓度为0.1-1.5mg/ml，壳聚糖的浓度为1-15mg/ml。2. 根据权利要求1所述的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴 眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1 : 1，Nogo66蛋白的浓度为1-1. 5mg/ml，壳聚糖 的浓度为10-15mg/ml。3. 根据权利要求1所述的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴 眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1 : 1，Nogo66蛋白的浓度为lmg/ml，壳聚糖的浓 度为10mg/ml。4. 根据权利要求l-3任一所述的治疗和预防用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺翔鸽，程茗，谢琳，岳红云，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]