本发明专利技术提供了一种适用于五氯酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括包被了五氯酚抗原的酶标板、浓缩洗涤液、五氯酚标准品、五氯酚特异性抗体、酶标记物、显色液、反应终止液。检测已知浓度的五氯酚并绘制标准曲线，可以推算出待测五氯酚的浓度。本发明专利技术的优点是能准确灵敏地检测环境中的五氯酚残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。
Suitable for Pentachlorophenol residue analysis ELISA Kit
The invention provides a method for residue analysis of PCP ELISA kit, including coated PCP antigen ELISA plate, concentrated washing liquid, pentachlorophenol standard, PCP specific antibody, enzyme marker, color liquid, reaction termination liquid. Pentachlorophenol detection of known concentration and drawing the standard curve, it can calculate the measured concentration of pentachlorophenol. The advantages of the invention can accurately and sensitively detect pentachlorophenol residues in environment, has the advantages of simple sample pretreatment, less time-consuming, can simultaneously detect a large number of samples, sample testing cost is far lower than the traditional methods of detecting instrument.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及 一种酶联免疫吸附分析(ELISA )试剂盒，具体地说， 涉及一种适用于五氯酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒。
技术介绍
五氯酚用途广泛，作为农药主要为其钠盐，可用作杀菌剂、防腐剂、除草剂，还可作为木材的防腐剂，还有一部分作为溶剂、热交换工业生产废弃物被释放到自然环境中。五氯酚具有强大的生物毒性 是因为其具有生物解偶联作用，五氯酚的内分泌干扰作用表现在干扰机体正常的甲状腺素功能；干扰(模拟)雌激素和睾酮，从而影响人 类生育。我国城镇污水处理厂污染物排放标准GB 18918-2002中规 定，城镇污水处理厂排放五氯酚污染物浓度不得高于0.5mg丄，我 国GHZB1-1999地表水环境质量标准中规定地表水I、 II、 III类水域 有机化学物质特定项目五氯酚含量标准值为0.00028mg'L。常用的五氯酚的检测方法包括气相色谱法(GC)、高效液相色 谱法(HPLC)、气质联用法(GC/MS)、薄层色谱法(TLC)、分 光光度法(AAS)及上述方法的联用方法。应用这些理化分析技术对环 境、生物、食品等样品中痕量五氯酚残留进行分析，不仅仪器化程度 要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前处理过 程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，又 造成了新的环境污染。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品 量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，迫切 需要开发和应用高效率农药残留快速分析技术
技术实现思路
(一) 要解决的技术问题针对上述不足，本专利技术提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准 确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于环 境中五氯酚残留的批量、快速检测。(二) 技术方案为实现上述目的，本专利技术提供了一种五氯酚残留分析酶联免疫吸 附检测试剂盒，该试剂盒包括包被五氯酚抗原的酶标板、浓缩洗涤液、 五氯酚标准品、五氯酚特异性抗体、酶标记物、底物显色液、反应终 止液。其中，五氯酚特异性抗体的制备过程中所用的免疫原是半抗原四 氯对羟基苯氧丁酸与载体蛋白的偶联复合物，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清 白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白，优选为牛血清白蛋白； 所述多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为 兔源多克隆抗体。其中，包被了包被抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被抗原 是五氯酚的半抗原四氯对羟基苯氧丁酸与卵清蛋白的偶联复合物，所 用包被液可以是0.05 MpH 9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1% 明胶的上述包被液。其中，酶标记物为酶标二抗，标记酶可以是辣根过氧化物酶或碱 性磷酸酶。其中，浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7 ~ 9g、 磷酸二氢钾0.1~0.3g、磷酸氢二钠2~4g、氯化钾3~6g、吐温-20 0.5~3mL。浓縮洗涤液的浓度是正常使用时的50倍。当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由A液和B液组成， 显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲 基联苯胺，终止液为1 2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液。具体地说，A液配方可为每lOOOmL水中加入过氧化脲lg，10.3g柠檬酸，35.8gNa2 HP04'12 H20,吐温-20 100pL， pH5; B液配方可为每1000mL蒸馏 水中加入四甲基联苯胺(TMB) 700mg (40rnL DMSO溶解)，10.3g梓檬 酸，pH2.4-2.8。当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为 对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。本专利技术试剂盒 的分析原理是当酶标板预包被抗原时，加入待测五氯酚样品和五氯酚多克隆抗 体后，固相包被抗原和待测五氯酚相互竟争与抗体反应，由于每个孔 中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测的五氯酚浓度高 时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体 结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物显色液，显色反应浅，用酶标仪 检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测五氯酚浓度低时，则 所测的OD值高，抑制率低。根据用已知的五氯酚浓度检测所作的标 准曲线，可以推算出待测五氯酚的浓度。(三)有益效果本专利技术的优点是能准确灵敏地检测环境中的五氯酚残留，样品的 前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远 低于传统的仪器检测方法。本专利技术对解决大批量样品的五氯酚残留现 场监控技术具有重要的现实意义。具体实施例方式以下实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不用来限制本专利技术所 要保护的范围。实施例l试剂盒操作及结果计算待测样品经前处理后，用PBST定容备用。拆开真空包装袋并取 出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。配制0 ng .mL—1, 0.064 ng 'mU1, 0.32ngTiiL國1, 1.6ng*mL_1, 8ng'mL國1， 40ng'ml/1, 200ng'mL-1，1000 ng .m1/1的五氯酴标准液，加入50pL标样或处理好的样品到各 孔中，标样和样品做4个重复，加入50^iL稀释的抗体，37'C孵育30 分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在 吸水纸上拍干；加入按1:1000稀释好的酶标羊抗兔二抗lOO(iL, 37 匸孵育30分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取A 液和B液等体积混匀，每孔加100iiL，在37'C显色30分钟，每孔加 入5(^1的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的 OD值。将含0 ng TnL标准品孔的OD值减去含最大浓度标准品孔的 OD值定为B0，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B;以B/B0 值为纵坐标，相应标准品浓度的log值为横坐标，绘制五氯酚标准抑 制曲线。根据曲线的回归方程可以求出对应样品的浓度，也可以求出 五氯酚抑制中浓度IC5Q( B/Bq=50% )及最小检测限IC2()( B/BQ=80% )。 标准抑制曲线的回归方程为Y = -0.25X + 0.049， R2 = 0.98，此曲线的 抑制中浓度为IC50=16ng .mL—1， IC20 = 0.6ng 'mL—1。实施例2半抗原四氯对羟基苯氧丁酸的合成向250mL圆底三口烧瓶中加入丙酮溶剂约lOOmL,在氮气保护 下，加入3g ( 12.15mmol)四氯对二苯酚和10g ( 72.5mmol)碳酸钾, 搅拌使尽量溶解，将1.58g (8.1mmol) 4 -溴丁酸乙酯溶于少量丙酮 中，逐滴加入到反应液中，开始加热回流，大约12h。经薄层液相色谱(TLC)检测，反应完全，减压脱去丙酮溶剂。 反应物用50mL去离子水溶解，再加入30mL乙酸乙酯，充分振荡， 静置分层，保留水相。在水相中加入稀盐酸溶液调节pH至3,用乙 酸乙酯50mLx2萃取水相，合并有机相，有机相用50mL水洗涤，脱 去溶剂，得到粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯。将制得的粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯0.5g加入反应器中，加 入10%的氢氧化钠溶液lOmL,再加入20mL甲醇溶液，在38'C下加热回流4h，进行脱酯化。经TLC检测反应完成后，脱去溶剂，经柱层析分离得到目标产物。实施例3五氯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于五氯酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括包被五氯酚抗原的酶标板、浓缩洗涤液、五氯酚标准品、五氯酚抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。
【技术特征摘要】
1.一种适用于五氯酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括包被五氯酚抗原的酶标板、浓缩洗涤液、五氯酚标准品、五氯酚抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。2. 根据权利要求1所述的酶联免疫吸附检测试剂盒，其中，五 氯酚抗体在制备过程中所用的免疫原是半抗原四氯对羟基苯氧丁酸 与载体蛋白BSA的偶联复合物；所述五氯酚抗原是半抗原四氯对羟 基苯氧丁酸与载体蛋白OVA的偶联复合物。3. 根据权利要求1或2所述的酶联免疫检测试剂盒，其中，所 述酶标记物为酶标二抗。4. 根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其中，所述酶 标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。5. 根据权利要求l或2所述的酶联免疫吸附检测试剂盒，其中， 浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7~9g、磷酸二氢 钾0.1 0.3g、磷酸氢二钠2 4g、氯化钾3 6g、...
【专利技术属性】
技术研发人员：李季，许艇，井宏宇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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