一种重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法技术

一种重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法，属于环境水样中重金属汞的测定方法。以特异性识别汞－螯合剂ＥＤＴＡ复合物Ｈｇ－ＥＤＴＡ的单克隆抗体为基础，将包被原汞－螯合剂－蛋白包被在９６孔酶标板上；４℃孵育过夜后用含１％明胶的磷酸盐缓冲液ＰＢＳ封闭，洗板后加入特异性汞单克隆抗体与待测样品的混合溶液，３７℃孵育后洗版，加入酶标二抗，３７℃孵育，洗板后加入酶反应底物，孵育后加入终止反应液终止反应，然后用酶标仪测定各孔吸光度值。得到标准竞争抑制曲线，再对曲线进行Ｌｏｇｉｔ转换，绘制出样品中汞的标准曲线，从而进行定量分析。本方法适合环境水样中痕量汞的测定，同时为重金属污染突发事故的现场快速检测提供技术支持，便于及时对污染事故进行补救和恢复工作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重金属汞的快速、准确、高通量测定方法，具体为一种基于 重金属汞单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附测定方法(ELISA方法)。
技术介绍
重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，天然水体中含荥量极少， 一般 不超过0.1 pg/L，我国饮用水标准限值为0.001 mg/L。但由于人类对重金属的 开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如镉、汞等进入大 气、水、土壤环境，引起严重的环境污染，以各种化学状态或化学形态存在的重 金属，在进入环境或生态系统后就会存留、积累和迁移，造成危害，并能通过饮 用水或者通过生物富集以及食物链等方式最终危害人类的健康。因此，建立准确、 快速、便捷、高通量的重金属汞的检测方法，对汞污染进行长期监测，了解其在 环境介质中的浓度，对控制污染，保护环境和人类生命安全与健康具有十分重要 的意义。文献检索结果表明，国外Willy等首次制备了能特异性识别重金属汞的单克 隆抗体(Wylie, D.E., et al. Monoclonal-antibodies specific for mercuric ions [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(9): 4104-4108)，并初步用于水体中汞的检测，但是检测范 围相对比较窄，为0.5-10ppb (Wylie, D.E., et al. Detection of mercuric ions in water by Elisa with a mercury-specific antibody [J]. Analytical Biochemistry, 1991， 194(2): 381-387)。国内杨凤丽等在《高技术通讯》(2008.5)上发表了 题为重金属汞单克隆抗体的制备及鉴定，该文介绍了制备汞单克隆抗体的方法 及抗体鉴定。但这些都没有用于建立标准化的免疫检测方法。当前，国际上对重金属检测的发展方向是灵敏、准确、实时、快速、选择性 好和适用范围广等。而传统的汞的检测技术大多需要大型或专门仪器(原子吸收 光谱法、原子荧光光谱法和电感耦合等离子体-质谱法等)才能完成，且前处理 过程复杂，耗时较多，分析工作只能在室内进行，难以满足高通量快速和在线检测的需要。因此，发展用于快速检测重金属汞的新方法和新技术极具现实意义。 但是，目前国内外关于这方面的研究进展缓慢，尚未形成行之有效的成熟技术。 基于抗原、抗体特异性结合作用的间接竞争酶联免疫吸附测定方法具有检测速度 快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，且能同时分析大量 的环境样本，已广泛应用于临床医学、生命科学以及环境中有机有毒物质的检测。但在用于重金属汞的检测上一直未有所突破。
技术实现思路
1. 专利技术要解决的技术问题针对现有的重金属镉汞检测方法存在的问题，本专利技术提供一种重金属汞间接 竞争酶联免疫吸附测定方法，基于高特异性、高效价的汞单克隆抗体快速、准确、 高通量的间接竞争酶联免疫吸附测定，可用于环境水样的快速检测。2. 技术方案 本专利技术是通过以下技术方案来实现的(即间接竞争酶联免疫吸附测定方法(CI-ELISA))，以特异性识别汞-螯合剂EDTA复合物Hg-EDTA的单克 隆抗体为基础，首先将包被原汞-螯合剂-蛋白(Hg-ITCBE-BSA)包被在96孔 酶标板上，4 'C孵育过夜后用含1%明胶的磷酸盐缓冲液PBS封闭，洗板后加入 特异性汞单克隆抗体与待测样品的混合溶液，37t:孵育后洗版，加入酶标二抗， 37t孵育，洗板后加入酶反应底物，孵育后加入终止反应液终止反应，然后用 酶标仪测定各孔吸光度值。以下通过详细的步骤对本专利技术做进一步的具体限定预先将1000 mg/L金属汞标准液稀释成200 mg/L储备液，调节pH至需要 值。以稀释缓冲液PBS配置一定浓度的EDTA溶液，即为PBSE溶液。用蒸馏 水将储备液稀释成系列浓度的标准溶液。再和EDTA反应生成系列浓度的 Hg-EDTA复合物溶液作为竞争化合物，加入酶标板。在此过程中，保证每一浓 度的标液中含EDTA的量是一致的。具体的实验步骤如下(1)包被以包被缓冲溶液CBS稀释包被原至抗原工作浓度，100ijL/孔， 4'C过夜或37°C2小时。(2) 洗板以PBST为洗液，在洗板机上进行洗涤，每板洗三次，每次每孔注液300(jL，拍干。(3) 封闭以1%明胶为封闭液，200nL/ L， 37'C孵育1h。(4) 洗板；同(2)，拍干。(5) 预混合取系列浓度的Hg^溶液各100yL与900jjLEDTA混合后，将 混合液与PBS稀释后的抗体等体积混合至1mL，在室温下作用一段时间。同时 以EDTA与稀释抗体混合液做阳性对照。(6) 竞争将预混好的各浓度的标准样品加入96孔酶标板中，100pU孔， 37。C孵育2 h。(7) 洗板同(2)，拍干。(8) 加羊抗鼠酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP以封闭液稀释(1:10000)， 100 jjL/ 孔，37'C孵育1 h。(9) 洗板同(2)，拍干。(10) 加底物液(100 |jL 10 mg/mL的TMB和25 口1_0.65%11202溶于9.875 mLCPBS，使用前现配使用)100pL/孔，37。C显色15min。(11) 终止反应加浓度为2 M的硫酸溶液终止显色反应，50pL/孔。(12) 测定、计算酶标仪测定OD45o值，以空白对照调零，以EDTA与 抗体混合液孔作为阳性对照。阳性对照孔(不含竞争化合物)与加样孔(含有一定浓度竞争化合物)测得的od450的差值与阳性对照孔测得的OD450的比即为抑制率。计算公式如下-(9化-(9c ，通过对抑制率和标准样品中汞的浓度的对数值作图，得到标准竞争抑制曲 线，再对曲线进行Logit转换，即以各孔吸光度值的Logit值为纵坐标，以标准 样品中汞的浓度的负对数值为横坐标，绘制出样品中汞的标准曲线，各孔吸光度 值的Logit值与标准样品中汞的浓度的负对数值成直线相关，从而进行定量分析。所述的汞单克隆抗体，是经Hg-ITCBE-KLH为免疫原，采取腹腔注射的方式 免疫BALB/c鼠，并经杂交瘤技术获得，此处并不是本专利技术所要保护的专利技术点， 可以自己制备获得，也可以通过汞单克隆抗体的制备方提供来获得。本专利技术的基本原理是首先将包被原包被在酶标板上，然后将抗体与小分子半 抗原混合物作为样品加入，小分子半抗原与包被在酶标板上的包被抗原之间发生 竞争性结合反应。样品中小分子半抗原的浓度越高，与之结合的抗体的量相对就 越多，结合在包被抗原上的抗体量就越少，加入酶标二抗后，发生的显色反应就 越浅，OD450值越低。反之亦然。通过OD450值的变化进行半定量或定量分析。3.有益效果-本专利技术提供的重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法，使得重金属汞快速、 准确、高通量测定，在高特异性汞单克隆抗体的基础上，建立了测定环境水样中 汞含量的间接竞争酶联免疫吸附测定方法。本方法适合环境水样中痕量汞的测定。 同时为重金属污染突发事故的现场快速检测提供技术支持，便于及时对污染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于以特异性识别汞－螯合剂ＥＤＴＡ复合物Ｈｇ－ＥＤＴＡ的单克隆抗体为基础，将包被原汞－螯合剂－蛋白包被在９６孔酶标板上；４℃孵育过夜后用含１％明胶的磷酸盐缓冲液ＰＢＳ封闭，洗板后加入特异性汞单克隆抗体与待测样品的混合溶液，３７℃孵育后洗版，加入酶标二抗，３７℃孵育，洗板后加入酶反应底物，孵育后加入终止反应液终止反应，然后用酶标仪测定各孔吸光度值。

【技术特征摘要】
1.一种重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于以特异性识别汞-螯合剂EDTA复合物Hg-EDTA的单克隆抗体为基础，将包被原汞-螯合剂-蛋白包被在96孔酶标板上；4℃孵育过夜后用含1％明胶的磷酸盐缓冲液PBS封闭，洗板后加入特异性汞单克隆抗体与待测样品的混合溶液，37℃孵育后洗版，加入酶标二抗，37℃孵育，洗板后加入酶反应底物，孵育后加入终止反应液终止反应，然后用酶标仪测定各孔吸光度值。2. 根据权利要求书1所述的重金属汞间接竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征 在于通过以下步骤作进一步的具体限定(1) 包被以包被缓冲溶液CBS稀释包被原至抗原工作浓度，100pL/ L， 4°C 过夜或37'C2小时；(2) 洗板以PBST为洗液，在洗板机上进行洗涤，每板洗三次，每次每孔注 液300 pL，拍干；(3) 封闭以1%明胶为封闭液，200pL/孔，37。C孵育lh。(4) 洗板；同步骤(2)，拍干；(5) 预混合取系列浓度的Hg^溶液各100)_iL与900pLEDTA混合后，将混合 液与PBS稀释后的抗体等体积混合至lmL，在室温下作用一段时间。同时以 EDTA与稀释抗体混合液做阳性对照；(6) 加样反应将预混好的各浓度的标准样品加入96孔酶标板中，100pL/孔， 37'C孵育2h;(7) 洗板同(2)，拍干；(8) 加羊抗鼠酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP以封闭液稀释(1:10000)， 100nL/孑L， 37孵育1 h;(9) 洗板同(2)，拍干；(10)...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙成，何欢，喻恺，杨绍贵，徐敏杰，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[]