【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于色谱检测，具体涉及一种l-缬氨酸中杂质氨基酸的检测方法。
技术介绍
1、l-缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，属于支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，也是哺乳动物的必需氨基酸和生糖氨基酸，其能促进身体正常生长、修复组织、调节血糖，在食品/饲料添加剂、调味品、保健品、医农药等领域有着广泛的应用。
2、高纯缬氨酸的生产方法主要有：提取法、微生物发酵法、酶催化法和化学合成法。其中，生物发酵法生产缬氨酸成本较低、易大规模生产，是全球缬氨酸生产的主要方式。当前高纯缬氨酸产能主要集中在日本，日本缬氨酸纯度较高，达到99.3％以上，广泛应用于医药领域，包括医药原料中间体的制造，如l-缬氨酸甲酯盐酸盐、l-缬氨酸乙酯盐酸盐、n-甲基-l-缬氨酸、n-乙酰-l-缬氨酸等。而我国高纯缬氨酸生产存在杂酸高、发酵周期长、提取手段落后、产品纯度低等问题，目前国产l-缬氨酸由于纯度较低，多用在饲料等其他领域，医药领域需求的高纯度缬氨酸仍旧依赖进口。
3、高纯l-缬氨酸生产使用的原料是粗品l-缬氨酸，粗品中含有各种杂质氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等，高纯-l缬氨酸对单个杂质氨基酸残留要求≤0.02％，因此需要对高纯l-缬氨酸生产中产生的杂氨基酸量进行严格控制。但是受氨基酸结构限制，多数氨基酸官能团对紫外吸收较弱，现有高效液相色谱-紫外检测法的定量限很难满足高纯l-缬氨酸中杂酸残留量的检测要求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种l-缬氨酸
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种l-缬氨酸中杂质氨基酸的检测方法，其采用高效液相色谱法检测，所用色谱柱为硅胶基c18反相色谱柱，流动相为磷酸盐溶液和乙腈溶液的混合溶液。
3、优选地，所述色谱柱的规格为3.9x150mm，4μm；
4、所用检测器为uv紫外检测器，紫外检测波长为330-350nm，具体可为340nm。
5、优选地，所述流动相流速为0.6-1.2ml/min，具体可为1.0ml/min。
6、优选地，流动相梯度洗脱程序如下：
7、
8、其中，流动相a为磷酸盐溶液，流动相b为乙腈溶液。
9、柱温为35-45℃，具体可为40℃；
10、进样体积为20μl。
11、优选地，所述磷酸盐溶液为0.05mol/l磷酸氢二钠缓冲液。
12、优选地，所述乙腈溶液为70％-90％乙腈水溶液。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述检测方法包括下述步骤：
14、1)配制高纯l-缬氨酸中待测杂质氨基酸的混合标准溶液，柱前衍生化后进样检测，得出浓度-色谱峰定量参数相关性；
15、2)在与步骤1)相同的检测条件下检测待测样品溶液的色谱峰定量参数，基于浓度-色谱峰定量参数相关性，得到待测样品中各杂质氨基酸的残留量。
16、优选地，所述柱前衍生的方法为：在缓冲溶液条件下，将高纯l-缬氨酸中待测杂质氨基酸的混合标准溶液或待测样品溶液与opa衍生试剂发生衍生化反应；
17、所述待测杂质氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述检测方法包括下述步骤：
19、1)配制谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合标准溶液，采用opa柱前衍生化后进样检测，在色谱图中分别找出谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸的峰面积；
20、2)配制待测样品溶液，并按照步骤1)柱前衍生后进样检测，在其色谱图中分别找出待测样品溶液中谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸对应的峰，通过外标法计算各杂质氨基酸的残留量。
21、进一步地，所述柱前衍生的方法为：在缓冲溶液条件下，将谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合标准溶液或待测样品溶液与opa衍生试剂发生衍生化反应。
22、优选地，所述缓冲溶液为硼酸缓冲液，所述硼酸缓冲液的ph为10-10.2。
23、优选地，步骤1)中，所述谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合标准溶液中，谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸的浓度均为0.0005g/l；
24、所述谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合标准溶液与硼酸缓冲液、opa衍生试剂的体积比可为5：6：4。
25、本专利技术的有益效果在于：本专利技术开发了一种通过硅胶基c18反相色谱柱及特定流动相和洗脱程序分离测定高纯l-缬氨酸中杂质氨基酸残留的方法，该方法检测信噪比高，理论塔板数高，定量限低至0.01-0.04μg/ml，满足对单个杂质氨基酸残留要求≤0.02％的检测要求。
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1.一种L-缬氨酸中杂质氨基酸的检测方法，其特征在于，其采用高效液相色谱法检测，所用色谱柱为硅胶基C18反相色谱柱，流动相为磷酸盐溶液和乙腈溶液的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为3.9x150mm，
3.根据权利要求1-2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.6-1.2mL/min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，流动相梯度洗脱程序如下：
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为35-45℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液为0.05mol/L磷酸氢二钠缓冲液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述乙腈溶液为70％-90％乙腈水溶液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述柱前衍生的方法为：在缓冲溶液条件下，将高纯L-缬氨酸
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为硼酸缓冲液，所述硼酸缓冲液的pH为10-10.2。
...【技术特征摘要】
1.一种l-缬氨酸中杂质氨基酸的检测方法，其特征在于，其采用高效液相色谱法检测，所用色谱柱为硅胶基c18反相色谱柱，流动相为磷酸盐溶液和乙腈溶液的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为3.9x150mm，
3.根据权利要求1-2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.6-1.2ml/min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，流动相梯度洗脱程序如下：
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为35-45℃。
6.根据权利要求1-5...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡兆锋，汪艳，刘安兴，张贝贝，
申请(专利权)人：安徽华恒生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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