蚯蚓纤溶酶抗肝纤维化的应用制造技术

本发明专利技术涉及蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。属于生物技术领域。蚯蚓纤溶酶口服抗肝纤维化的有效剂量为１０００－３０００尿激酶单位／人．日。试验证明，蚯蚓胶原酶可降解胶原蛋白但它不能降解（牛血）纤维蛋白；蚯蚓纤溶酶可降解（牛血）纤维蛋白，更可降解胶原蛋白，活性高于蚯蚓胶原酶与胶原酶标准品（Ｓｉｇｍａ　Ｉ型）。在大鼠进行的抗肝纤维化实验证明，口服蚯蚓纤溶酶抗肝纤维化效果显著而且无明显毒副作用，但口服蚯蚓胶原酶抗肝纤维化效果不显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蚯顿纤溶酶(即蚓激酶)抗肝纤维化的应用，属于生物
二
技术介绍
1.肝纤维化是一切慢性肝病的共同的病理基础，是发展到肝硬化必经的中 心环节。肝纤维化是肝细胞的细胞外基质(主要为胶原蛋白、其次为结构糖蛋 白、糖胺多糖和弹性蛋白)的分泌大于降解，因而造成细胞外基质过度沉积的 病理过程。肝纤维化的病因大致可分为感染性(慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎、 血吸虫病等)，化学代谢缺陷(慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病)，先天性 代谢缺陷以及自身免疫性肝炎等。单就乙型肝炎而言，全世界乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者超过2.8亿；我 国是乙型肝炎高流行区，有1.3亿人口是HBsAg携带者，慢性乙型肝炎患者超过3000 万，其中25-40%的患者可发展为肝硬化或肝癌。每年我国死于乙肝后肝硬化、肝癌 患者达40万人。肝穿刺标本分析表明，轻型慢性肝炎患者发生肝纤维化者占62.6%， 中度、重度慢性肝炎患者100%出现肝纤维化。近年的基础和临床研究表明，肝纤维化尤其早期肝纤维化是一种可逆的病理过 程，除了有效的病因治疗，如果能直接抑制肝细胞外基质的合成和/或促进其降 解，则已经形成的肝纤维化甚至早期肝硬化也是可以逆转的。因此，抗纤维化治 疗已成为国内外肝病专家关注的热点。彻底治疗慢性肝炎的原发病不能完全代替抗纤维化治疗，如同有的患者HBeAg 已转阴，但肝纤维化仍在进展。抗纤维化药物的作用分为抑制胶原蛋白的合成、分泌 与沉积以及促进细胞外已经沉积的胶原蛋白的降解。因此抗纤维化治疗主要针对两个 方面进行(1)抑制肝星状细胞活化，抑制肝星状细胞的胶原合成，促进肝星状细 胞凋亡；(2)抑制细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)合成、增加细胞外基质降 解；抑制基质金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor metalloproteinase-l TIMP-1)的 合成、提高基质金属蛋白酶(matrix metal-loproteinase， MMPs)活性。对于慢性肝纤维化的治疗尚无理想药物，目前主要用干扰素-Y、甘草甜素、秋水 仙碱、中成药安络化纤丸。前者属于抗病毒治疗，前两种药肌肉或静脉注射，6个月 为一疗程；秋水仙碱口服有疗效但毒副作用较大、需连服一年；安络化纤丸日服 12-16g、有一定疗效、有一定副作用。我们前一阶段用多组分的蚯蚓粗提物-地龙2号进行了抗肝纤维化试验Wistar 雄性大鼠每周2次皮下注射C-C14制造肝纤维化动物模型，阳性对照组以秋水仙碱灌 胃，试验组用不同剂量地龙2号灌胃、每日l次，试验共8周。试验结束时取大鼠 肝脏、作组织切片、HE染色、显微镜观察。结果显示地龙2号灌胃产生显著的 抗肝纤维化效果，优于秋水仙碱的治疗效果，而且未见明显毒付作用。通过免疫组化 和RT-PCR方法，对各组大鼠肝组织中基质金属蛋白酶(MMP-13)与基质金属蛋白 酶组织抑制物(TIMP-1)的蛋白含量以及mRNA的表达进行分析地龙2号治疗组 MMP-13的表达明显升高，TIMP-1的表达显著下降，MMP-13 / TIMP-1的mRNA 表达的比值也显著下降。同时，试验组肝星状细胞的活化受到明显的抑制。由此， 我们曾经推测，可能是地龙2号中含量较高的两种蛋白酶一蚯蚓胶原酶、蚯蚓纤 溶酶(即衂激酶)口服产生的效果；同时推测，与细胞外基质的主要成分-胶原蛋白 对应的蚯蚓胶原酶、可能是抗肝纤维化的最主要成分。这当然只是未经验证的推测， 它无法确定哪一种蛋白酶或者两种活性物质怎样的配比才真正有效，更无法确定抗 肝纤维化新药的配方与含量。本专利技术通过大量的后续系列实验结果，推翻了前一阶段 的推测。2.人体胶原酶(MMPs)以无活性的酶原形式分泌，纤溶酶是激活人体胶原酶原的重要因子，同时又是血清蛋白酶级联反应通路与MMPs介导的通路之间的交换蛋白酶，它能有效激活MMP-1和MMP-3 (Murphy G，Stanton H，Co丽ll S，et al.，Mechanisms for pro matrix metalloproteinase Activation. APMIS， 1999， 107(l):38-44.)。己知蚯蚓纤溶酶口服可进入血流并保持纤溶酶活性，已作为口服溶血栓药用于临床。 但是它能否水解纤维化肝脏的细胞外基质(ECM)或/和激活MMPs的酶原、从而加 速肝脏胶原蛋白的降解？尚无这方面的报道。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于提供一种毒副作用低、疗效显著的抗肝纤维化新药或保肝保健食品。在前一阶段地龙2号抗肝纤维化试验的基础上，通过进一步分离、 提纯、测定以及动物试验，阐明多组分的地龙提取物-地龙2号中，真正有效的 抗肝纤维化成分以及有效的口服剂量。 技术方案蚯虫引纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。口服有效剂量为 1000-3000尿激酶单位uku/人.日。所述蚯蚓纤溶酶包括提纯的蚯蚓纤溶酶、不含 蚯蚓胶原酶的蚯蚓纤溶酶的提取物、含蚯蚓纤溶酶的多组分的蚯蚓粗提物、蚯蚓冻干 粉、蚯顿低温干燥粉或含蚯蚓纤溶酶的复方制剂。有益效果多组分的地龙2号为原料，分别提取两种含量较高的活性物质一虹蚓 胶原酶、蚯蚓纤溶酶，分别在体外和动物体内进行检测和研究① 胶原蛋白(I型为主)是肝纤维化-肝硬化肝脏的细胞外基质的最主要成分。 分别提取蚯蚓胶原酶、蚯蚓纤溶酶，在体外检测它们水解胶原蛋白的活性。② 基质金属蛋白酶是细胞外基质降解过程中最重要的一组蛋白酶，胶原酶是其 家族的主要成员之一。这组蛋白酶通过降解细胞外基质的主要成份一胶原蛋白，对抑 制肝纤维化的发生、发展起着重要作用。已知蚯蚓胶原酶至少有3个同功酶、分子量 在92KD左右，它们可特异性地降解胶原蛋白，但是口服能否进入血流并在肝脏发挥其 生物活性？最直接、最可靠的验证方法是提取蚯蚓胶原酶、给肝纤维化病变过程中 的大鼠灌胃，比较观察它对肝纤维化进程的影响。③ 已知赤子爱胜蚓的纤溶酶(蚓激酶)至少有6个同功酶，口服有15%左右可进 入血流并保持生物活性，可直接、间接降解血栓的主要成份-纤维蛋白，已用于血栓病 的临床治疗。但是它们能否直接、间接降解肝细胞外基质的胶原蛋白或/和激活肝脏 胶原蛋白酶(MMPs)的酶原？最直接、最可靠的验证方法依然是提取蚯蚓纤溶酶、 给肝纤维化病变过程中的大鼠灌胃，比较观察它对肝纤维化进程的影响。 将前一阶段的试验材料一 地龙2号经S印hadex G75凝胶层析，分离胶 原酶组分和纤溶酶组分，分别在胶原蛋白平板、(牛血)纤维蛋白平板测定各组分的 活性和含量；同时分别测定目前的试验材料一蚯蚓胶原酶、蚯蚓纤溶酶的活性，依据 前后数批抗肝纤维化动物试验的结果，确定抗肝纤维化的有效剂量范围。我们曾经推测，可能是地龙2号中含量较高的两种蛋白酶一蚯虫引胶原酶、蚯 蚓纤溶酶(即蚓激酶)口服产生的效果；理论上推测，与细胞外基质的主要成分-胶原蛋白对应的蚯蚓胶原酶应该是抗肝纤维化的最主要成分。这些当然只是未经验证的 推断，基于推断也无法确定哪一种蛋白酶或者两种活性物质怎样的配比才真正有效， 更无法确定抗肝纤维化新药的配方与含量。本专利技术通过大量的后续系列实验，取得了 意想不到的效果，推翻了前面的理论本文档来自技高网...

【技术保护点】
蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。

【技术特征摘要】
1、蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。2、 根据权利要求1所述蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保健食品中的应用，其特征在于，口服有效剂量为1000-3000尿激酶单位uk...

【专利技术属性】
技术研发人员：张治国，张晓蓉，连桂芳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]