【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，具体涉及一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用。
技术介绍
1、透明质酸(hyaluronic acid，ha)又名玻璃酸，是人体中重要的成分，由n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)和d-葡萄糖醛酸(glca)二糖重复单位通过β-1,4-糖苷键和β-1,3-糖苷键构成的无分支结构的高分子酸性黏多糖，具有很强的亲水性和非常好的保湿性能，广泛存在于皮肤、软骨、关节、玻璃体等生物组织中，具有重要的生理学功能。根据其分子量不同可以分为高分子量ha(hmwha)和低分子量ha(lmwha)，hmwha能够抑制内皮细胞的迁移，具有抗血管生成活性，促进人体伤口愈合；lmwha能够促进内皮细胞的分化，抗细胞凋亡，促进软骨、内皮等细胞的迁移，还具有抗炎的作用。ha以其独特的理化性质，在医学和药学研究方面发挥了重要的作用。
2、目前低分子量ha在制备时，主要是通过物理、化学和酶等降解方法将大分子透明质酸降解为低分子量ha。但是物理降解法通常得不到超低分子量的ha，化学降解法可能会导致制备的低分子量ha产品中有化学试剂的残留，并且可能会对透明质酸单体中醛酸或羟基基团产生修饰作用，因此化学法可能会破坏低分子量ha结构。
3、酶降解法由于其专一性强，反应条件温和，且多糖的结构未发生变化，可通过控制不同降解时间，得到不同分子量ha，是制备低分子量ha理想的方法。透明质酸酶(hyaluronidase，haase)是一种将高分子量ha降解为低分子量或寡聚ha的糖苷酶，部分haase还具有降解软骨素和肝素的能力。haa
4、目前haase的产业化一直未得到突破，市场上尚没有针对特定低分子量ha降解的商业用酶，由于haase的来源非常有限，现有技术主要是从牛睾丸提取获得的，价格昂贵，在很大程度上限制了它们的应用；微生物来源酶的酶学性质丰富多样，且易于重组表达和提高产量，是未来应用酶制剂的主要来源。另一方面微生物生长繁殖快，生长周期短，培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，有很大的应用价值。因此，挖掘更多微生物来源的haase，摸索纯化出高酶活的haase，提供一种制备haase的方法，并应用于制备低分子量及寡聚透明质酸钠，具有重要的研究意义。
5、目前微生物来源的haase表达方式主要分为两种，一种是胞外分泌表达，如酵母、芽胞杆菌发酵产透明质酸酶；一种是胞内表达，如柠檬酸杆菌、大肠杆菌发酵产透明质酸酶。
6、中国专利cn117448305a公开了一种酵母发酵产水蛭透明质酸酶的方法及其应用，该专利技术将发酵液离心取上清，经洗脱纯化蛋白，收集洗脱峰得到粗酶液，其发酵上清液经纯化后酶活由2.414×106u/ml提升为4.698×106u/ml，发酵上清液中酶活高，但是纯化后酶活虽然有所提升但仍然不高，并且发酵周期耗时较长，需7-10天。
7、中国专利cn112501088a公开了一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法，该专利技术将培养后的透明质酸酶发酵液于10000-15000rpm条件下离心10-20min去除沉淀，得到上清液，用硫酸铵沉淀上清液，之后离心或过滤收集粗蛋白；用磷酸盐缓冲液复溶收集的粗蛋白，经超滤或透析除去小分子杂质后得到纯化后的透明质酸酶，其过程繁琐，纯化中使用硫酸铵沉淀，对硫酸铵需求大，并不适用于工业化大量制备透明质酸酶。
8、中国专利cn117568222a提供了一种葡萄牙柠檬酸杆菌、透明质酸酶及其制备方法、应用，该专利技术对葡萄牙柠檬酸杆菌培养后的菌液，离心处理后进行破碎，得透明质酸酶，其酶活为1000-10000u/ml，由于没有对后续粗酶液进行纯化富集，并不适用于工业化生产制备低分子量及寡聚透明质酸钠。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用，利用纯化后的高酶活透明质酸酶，酶解大分子透明质酸钠，制备低分子量及寡聚透明质酸钠，制备的透明质酸酶液发酵周期短，适用于工业化大量制备透明质酸酶，纯化后的透明质酸酶酶活高，适用于工业化生产制备低分子量及寡聚透明质酸钠。
2、为解决以上技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：
3、一种重组透明质酸酶的制备方法，包括：菌体破碎，预处理，纯化；
4、所述菌体破碎，将重组大肠杆菌进行高密度发酵培养，得到发酵液，发酵液经破碎后，得到破碎液；
5、所述预处理，将破碎液进行第一次离心收集沉淀，得到菌泥，按照菌泥：niabuffer为1:10-20重悬；高压破碎；对破碎液进行第二次离心收集上清；上清液抽滤除杂，得到重组菌上样液；
6、所述预处理中，第一次离心的转速为7000-9000rpm，时间为13-17min；
7、所述高压破碎的破碎压力为500-700bar，破碎次数为2-3次；
8、所述第二次离心的转速为12000-14000rpm，时间为25-35min；
9、所述抽滤中的滤膜精度为0.4-0.5μm；
10、所述纯化，采用akta蛋白纯化系统，利用镍柱亲和层析法进行纯化，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液；
11、所述纯化中的层析程序为：平衡，nia buffer 5cv；上样；漂洗，10% nib buffer10cv；洗脱，50% nib buffer 5cv；
12、所述nia buffer的组成为：25 mm磷酸盐缓冲液，50 mm咪唑，500 mm nacl，ph为7.4；
13、nib buffer的组成为：25 mm磷酸盐缓冲液，500 mm咪唑，500 mm nacl，ph为7.4；
14、前述重组透明质酸酶的应用，在37℃下，向纯水中加入重组透明质酸酶、大分子透明质酸钠，密封，酶解1-5h，过滤，向滤液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤至料液澄清，使用超滤膜进行分离，喷雾干燥，得到小分子透明质酸钠；
15、所述分离中超滤膜的精度为1wda，物料温度为30-35℃，压力为0.4-0.5mpa；
16、所述喷雾干燥中进风温度为170-180℃，出风温度为70-80℃。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
18、（1）本专利技术提供了一种重组透明质酸酶的制备方法，该重组透明质酸酶可以酶解大分子透明质酸或透明质酸钠，制备低分子量及寡聚透明质酸钠；
19、（2）本专利技术提供了一种重组透明质酸酶的制备方法，制备的重组透明质酸酶，纯度高、酶活高，因此在制备小分子透明质酸时，使用的酶量较少，酶解温度为37℃，酶解时间为1-5h，酶解得到的小分子透明质酸钠为二糖、四糖、六糖、八糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，包括：菌体破碎，预处理，纯化；
2.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述菌体破碎，将重组大肠杆菌进行高密度发酵培养，得到发酵液，发酵液经破碎后，得到破碎液。
3.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述预处理，将破碎液进行第一次离心收集沉淀，得到菌泥，按照菌泥：NiA buffer为1:10-20重悬；高压破碎；对破碎液进行第二次离心收集上清；上清液抽滤除杂，得到重组菌上样液。
4.根据权利要求3所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述预处理中，第一次离心的转速为7000-9000rpm，时间为13-17min；
5.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述NiA buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，50 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4；
6.一种权利要求1-5任一项所述的重组透明质酸酶的应用，其特征在于，在37℃下，向纯水中加入重组透明质酸酶、大分子透明质酸钠，密封，酶解
7.根据权利要求6所述的重组透明质酸酶的应用，其特征在于，所述分离中超滤膜的精度为1wDa，物料温度为30-35℃，压力为0.4-0.5Mpa；
...【技术特征摘要】
1.一种重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，包括：菌体破碎，预处理，纯化；
2.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述菌体破碎，将重组大肠杆菌进行高密度发酵培养，得到发酵液，发酵液经破碎后，得到破碎液。
3.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述预处理，将破碎液进行第一次离心收集沉淀，得到菌泥，按照菌泥：nia buffer为1:10-20重悬；高压破碎；对破碎液进行第二次离心收集上清；上清液抽滤除杂，得到重组菌上样液。
4.根据权利要求3所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述预处理中，第一次离心的转速为7000-9000rpm，时...
【专利技术属性】
技术研发人员：褚洪官，廉少杰，贾丙沂，郑德强，康传利，刘磊，王春喜，李庆，杜帅，汤丽伟，张美霞，刘蔷，张建，毛子寒，李姗姗，
申请(专利权)人：山东焦点福瑞达生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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