一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法技术

本发明专利技术属于酶固定化领域，具体是涉及一种利用乳液静电纺丝技术制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法。该方法是通过乳液电纺技术将漆酶原位包埋固定在电纺纤维中，其固定化漆酶的载体材料是具有良好生物相容性的聚乳酸—己内酯共聚物（Ｐ（ＬＡ／ＣＬ），７／３，即合成时聚乳酸与聚己内酯用量比例为７∶３）。具体包括两个步骤：载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定。载酶电纺纤维膜的制备是先将聚合物溶液和漆酶溶液配制成均质的乳液，然后将乳液进行静电纺丝，几小时后可收获载酶电纺纤维膜。对载酶电纺纤维膜进行交联固定是将膜暴露于戊二醛饱和蒸气中交联后即得到电纺纤维膜固定化漆酶。本发明专利技术提供了一种新的简单高效的制备固定化漆酶的方法，该方法所得的固定化漆酶催化活性高、稳定性好，且制备成本低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶固定化领域，具体为一种利用乳液静电纺丝技术制备聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)电纺纤维膜固定化漆酶的方法。
技术介绍
漆酶(Laccase， EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，1883年由日本学者从紫胶漆树的分泌物中发现。随着研究的深入，人们证实许多生物，包括高等植物、微生物(主要是真菌，部分是细菌)以及昆虫的体内都存在着漆酶。漆酶一般含有4个铜离子，根据光谱和磁性特征可将其分为三类I型Cu和II型Cu各一个，是单电子受体，呈顺磁性；III型Cu两个,是双电子受体，呈反磁性。I型C^+呈蓝色，在614nm处有特征吸收峰；II型C^+非蓝色，无特征吸收光谱；III型014+是偶合的离子对(012+-012+)，在330nm处有宽的吸收带。这4个铜离子处于漆酶的活性部位，在氧化反应中起决定作用。漆酶的氧化能力较强，并且作用的底物相当宽泛，其中包括多环芳烃、氯酚、多氯联苯及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素、除草剂、杀虫剂、染料等多种难降解的有机物。漆酶具有的优良特性为水体中有机污染物的降解提供了有效的途径，该方法具有条件温和、操作简单、对环境无污染等优点，在废水处理、生物漂白和生物传感器构建等方面有着巨大的应用前景。但由于游离漆酶易受环境条件影响而失活，难以实现重复利用且不能长期贮存，在实际应用中受到很大的限制。20世纪50年代兴起的酶固定化技术实现了漆酶应用手段的创新。固定化漆酶不仅是改善漆酶重复利用性和稳定性的有效手段，且在降低成本，保护环境，生产自动化、连续化等许多方面都十分有利，它为漆酶的应用开拓了广阔的前景。固定化漆酶的性能主要取决于固定化时所使用的载体材料的性质。理想的载体材料应具备良好的机械强度、热稳定性和化学稳定性、耐生物降解性及对酶的高度亲和性、并能保持较高的酶活性等。近年来各界学者对漆酶的固定化进行了广泛的研究，采用的固定化载体包括明胶、磁性微球、活性炭、壳聚糖、高分子聚合物和亲水性微滤膜等多种材料。其中高分子聚合物材料因为抗微生物性能良好，机械强度大，且有相当的价格优势，所以用其研制漆酶固定化载体的前景看好。静电纺丝纳米纤维膜就是一种以高分子聚合物为原料，利用静电纺丝技术制备而成的载体，具体是由聚合物溶液或熔体借助于高压静电作用进行喷射拉伸而形成超细纤维组成。因为静电纺丝纳米纤维膜具有孔隙率高、比表面积大、均一性好且制备简单等优点，它被人们认为是一种潜在的酶固定化基质。将其作为固定化酶的载体，有利于酶与底物充分接触，能有效提高酶的催化效率，且容易从反应体系中分离回收。但目前关于静电纺丝纤维膜固定化 酶的研究主要集中在后固定酶方面，即先制备纤维膜，然后再用一些方法将酶固定在原膜或 者修饰过的膜表面上。在这种情形下，尽管纤维膜有较大的比表面积，但酶只能单层固定在 纤维膜表面，酶载量相对较低，且反应过程中酶脱落严重，导致酶重复利用性差；如果直接 通过化学交联方法提高酶载量，酶活性会受到较大影响。乳液电纺是静电纺丝技术的一个新的分支，因其能够通过直接电纺油-水或者水-油乳液 制备壳-核结构药物纳米纤维而受到人们的关注。此外，乳液静电纺丝技术设备简单，反应条 件温和，易于操作，且成本低廉，是一种经济高效的制备载药物纳米纤维的方法。但目前还 未见有利用该方法固定化漆酶的研究。聚乳酸-聚己内酯共聚物是一种生物相容性良好且可生 物降解的高分子材料，它在自然界中可逐渐完全降解为二氧化碳和水，并不会对环境造成二 次污染，是一种环境友好材料。这种乳液电纺技术和环境友好材料的结合，为漆酶固定化技 术提供了一种新的思路，有着广阔的发展前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单高效的固定化漆酶的制备方法，即利用乳液静电纺丝技 术将漆酶原位包埋固定在聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3，即合成时聚乳酸与聚己内 酯用量比例为7:3)电纺纤维中的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种新型的载酶量高、稳 定性好、催化活性高，且生产成本低廉的电纺纤维膜固定化漆酶。本专利技术的技术方案是本专利技术提供的电纺纤维膜固定化漆酶是以具有良好生物相容性的高分子量聚乳酸一己内 酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)为载体材料，通过电纺聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)/聚氧 乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108/二氯甲烷溶液和漆酶水溶液混合形成的乳液，将漆 酶原位包埋固定在聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)电纺纤维中，并对载酶电纺纤维膜 进行交联固定。该电纺纤维膜固定化漆酶的制备方法包括两个步骤载酶电纺纤维膜的制备 及对其进行交联固定。其中载酶电纺纤维膜的制备步骤包括1) 将分子量为10万的聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3，即聚乳酸与聚己内酯合 成比例为7:3)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌2小时得 到共聚物混合凝胶；2) 称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至 全部溶解；3) 取步骤2)中所得漆酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为10毫克/毫升的 漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液；4) 将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷 射。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲垸完全挥发；5) 在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4~5小时后待纤维膜厚度达到0.5~1毫米，停止 纺丝。所得载酶纤维膜储存在4。C下备用；对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤包括1) 将所得载酶纤维膜剪成2x2厘米小方块，将其暴露于戊二醛水溶液饱和蒸气中，在35'C条件下交联；2) 取出交联后载酶纤维膜以pH值为3.5的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有 游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶，并将其储存在4'C下备用。本专利技术方法中，其中载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的嵌段共聚物表面活性剂为 聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量 为15500克/摩尔。本专利技术中聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL), 7/3)质量浓度为4%~6%，加入的嵌段共聚物 F108的用量为聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)质量的10%。本专利技术提供的利用乳液静电纺丝技术制备聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)电纺纤 维固定化漆酶方法具有如下优点1. 固定化载体聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)生物相容性好，用于酶固定化可以有 效保护酶活性，且用于环境污染物降解领域不会引入二次污染。2. 嵌段共聚物表面活性剂可显著降低混合凝胶的表面张力，有利于形成均质乳液；同时提 高了纤维膜整体的亲水性，对保持酶活性和稳定性起到重要作用。3. 以乳液静电纺丝技术制备载酶纤维膜，方法操作简单，条件温和，成本低，特别利于快速安置。4. 所制得的电纺纤维膜固定化漆酶载酶量高，酶活保持较好，且稳定性和重复利用性好， 可降低经济成本。附图说明图1为载酶聚乳酸一己内酯共聚物(P(LA/CL)， 7/3)电纺纤维膜在不同放大倍数下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法，该方法包括两个步骤：载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定；　　其中载酶电纺纤维膜的制备步骤包括：　　１）将分子量为１０万的聚乳酸－己内酯共聚物（Ｐ（ＬＡ／ＣＬ），７／３，即合成时聚乳酸与聚己内酯用量比例为７∶３）颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌２小时得到共聚物混合凝胶；　　２）称取１０毫克杂色云芝漆酶溶于１毫升ｐＨ值为３．５的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解；　　３）取步骤２）中所得漆酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为１０毫克／毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合２０分钟直至形成均质乳液；　　４）将步骤３）中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发；　　５）在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，４～５小时后待纤维膜厚度达到０．５～１毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在４℃下备用；　　对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤包括：　　１）将所得载酶纤维膜剪成２×２厘米小方块，将其暴露于戊二醛水溶液饱和蒸气中，在３５℃条件下交联；　　２）取出交联后载酶纤维膜以ｐＨ值为３．５的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶，并将其储存在４℃下备用。...

【技术特征摘要】
1.一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法，该方法包括两个步骤载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定；其中载酶电纺纤维膜的制备步骤包括1)将分子量为10万的聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3，即合成时聚乳酸与聚己内酯用量比例为7∶3)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶；2)称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解；3)取步骤2)中所得漆酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液；4)将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发；5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在4℃下备用；对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤包括1)将所得载酶纤维膜剪成2×2厘米小方块，将其暴露于戊二醛水溶液饱和蒸气中，在35℃条件下交联；2)取出交联后载酶纤维膜以pH值为3.5的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶，并将其储存在4℃下备用。2. 根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛军峰，代云容，刘佳，殷立峰，沈珍瑶，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]