【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分离领域和体液检测领域，特别是涉及一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法。
技术介绍
1、近年来，随着生活节奏加快和环境污染等问题日益严重，乳腺癌已成为全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织(who)的数据，2020年全球新增癌症人数共计1929万人，其中乳腺癌新增患者数达226万，首次超过肺癌，成为全球发病率最高的肿瘤。在这其中，中国的乳腺癌患病形势尤为严峻。据统计，每年新发病例数约为41.6万，呈现持续上升的趋势。细胞外囊泡不仅整体和外周膜蛋白组成与其母细胞相同，而且由于双层凹陷的过程，蛋白质拓扑结构也处于相同的方向。因此，癌症evp的膜蛋白提供与癌细胞相同的信息，并揭示了癌症的类型。因此，evp因其从母细胞遗传的独特遗传标记而成为乳腺癌检测和早期诊断的有前途的代表。
2、传统的evp分析方法通常基于蛋白质标记物（如cd63cd9)有不同类型的方法 ，例如蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定 (elisa ）。如公开号为cn1673745a，专利技术名称为“酶联免疫吸附elisa同步快速测定多项免疫指标的方法”的中国专利申请公开了一种利用酶联免疫吸附elisa同步快速测定多项免疫指标的方法，该方法可通过一次操作配制，同步检测多项免疫指标，检测速度快，节省人力、物力，降低检测成本。但是该方法使用过程中主要存在两个问题：一是由于直接elisa的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与elisa板结合，实验背景会比较高，而且直接elisa每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，以解决现有技术耗费时间和人力并且需要超速离心的问题，实现快速准确并且低成本的分离分类evp。
2、基于此，本专利技术公开了一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，包括如下步骤：
3、步骤一，配制不同浓度聚乙二醇（以下简称peg）的标准溶液，以用于后期分离细胞外囊泡颗粒（以下简称evp）；
4、步骤二，进行体液的预处理，减少干扰物质的影响，提高检测结果的准确性和可靠性；
5、步骤三，从体液（血液、唾液、尿液等）中分离出evp，对分离出来的evp进行适当的清洗，以去除可能的污染物；
6、步骤四，采用拉曼光谱仪对分离出来的evp进行检测，以获得所述evp的机器拉曼光谱图，再确定所述拉曼光谱图的峰面积；
7、步骤五，利用机器学习算法分离正常和各类乳腺癌的evp；
8、步骤六，在拉曼光谱数据库中快速搜索，找到与被分离evp相匹配的光谱数据，进而分类不同乳腺癌；
9、如权利要求1所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤一中，所述标准溶液中聚乙二醇的浓度分别为30%、40%，50%，60%，70%g/ml 。
10、如权利要求2所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤一中，所述标准溶液的配制方法:首先称取需要的peg2000（peg的分子量为2000）粉末，然后加入足量的去离子水(或其他纯水),使peg粉末溶解,得到30%、40%，50%，60%，70%g/ml 的peg2000水溶液，再使用磁力搅拌器,把peg2000完全溶解均匀，最后可通过过滤器将peg2000溶液过滤以去除任何残留物，得到聚乙二醇浓度为30%、40%，50%，60%，70%g/ml的对照溶液1，对照溶液2，对照溶液3，对照溶液4，对照溶液5。
11、进一步优选地，步骤一中，所述标准溶液的配制方法为：首先称取需要的peg2000（peg的分子量为2000）粉末，然后加入足量的去离子水(或其他纯水),使peg粉末溶解,得到30%、40%，50%，60%，70%g/ml 的peg2000水溶液，再使用磁力搅拌器,把peg2000完全溶解均匀，最后可通过过滤器将peg2000溶液过滤以去除任何残留物，得到聚乙二醇浓度为30%、40%，50%，60%，70%g/ml的对照溶液1，对照溶液2，对照溶液3，对照溶液4，对照溶液5。
12、优选地，拉曼光谱仪的检测参数为：激光源为532nm,激光功率为4.5mw,曝光时间为5秒，曝光次数为25次。
13、进一步优选地，拉曼光谱仪在1000至1800 cm^-1位移范围内扫描。
14、与现有技术相比，本专利技术至少包括以下有益效果：先配制聚乙二醇的标准溶液，利用聚乙二醇分离evp，然后通过机器学习算法分离不同evp，最后通过sers分类不同乳腺癌。相比于现有分离方法，如酶联免疫测定，本专利技术的分离方法实验灵活，灵敏度高，不存在交叉反应的可能性，也无需进行超速离心，而是直接通过peg分离evp，操作简单，易于掌握，省时省力，快速，高效;而且，现有的检测技术，需要超速离心机，分离成本非常高，而本专利技术的测定方法仅需peg标准溶液，即可完成分离，因此，大大降低了检测成本，利于普及和推广，因而本专利技术的分离分类方法具有广阔的市场应用前景。
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1.一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤一中，所述标准溶液中聚乙二醇的浓度分别为30%、40%，50%，60%，70%g/ml 。
3.如权利要求2所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤一中，所述标准溶液的配制方法:首先称取需要的PEG2000（PEG的分子量为2000）粉末，然后加入足量的去离子水(或其他纯水),使PEG粉末溶解,得到30%、40%，50%，60%，70%g/ml 的PEG2000水溶液，再使用磁力搅拌器,把PEG2000完全溶解均匀，最后可通过过滤器将PEG2000溶液过滤以去除任何残留物，得到聚乙二醇浓度为30%、40%，50%，60%，70%g/ml的对照溶液1，对照溶液2，对照溶液3，对照溶液4，对照溶液5。
4.权利要求1所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤二中，本专利以血液为例，对血液进行预处理，从血液中分离EVP。
<...【技术特征摘要】
1.一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤一中，所述标准溶液中聚乙二醇的浓度分别为30%、40%，50%，60%，70%g/ml 。
3.如权利要求2所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤一中，所述标准溶液的配制方法:首先称取需要的peg2000（peg的分子量为2000）粉末，然后加入足量的去离子水(或其他纯水),使peg粉末溶解,得到30%、40%，50%，60%，70%g/ml 的peg2000水溶液，再使用磁力搅拌器,把peg2000完全溶解均匀，最后可通过过滤器将peg2000溶液过滤以去除任何残留物，得到聚乙二醇浓度为30%、40%，50%，60%，70%g/ml的对照溶液1，对照溶液2，对照溶液3，对照溶液4，对照溶液5。
4.权利要求1所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤二中，本专利以血液为例，对血液进行预处理，从血液中分离evp。
5.权利要求1所述的一种新型细胞外囊泡的分离及各类乳腺癌的分类方法，其特征在于，步骤二中，血液预处理的方法：一、采集血液样本：从肘静脉取血采集血液样本，为确保样本的质量，采血时需遵循标准操作流程，避免血液凝固和细胞损伤。二、抗凝：向血液样本中加入抗凝剂（如肝素或edta），以防止血液凝固。抗凝剂能够与血液中的钙离子结合，降低凝血酶的活性，从而阻止血液凝固。三、血液离心：将采集的血液样本进行离心处理，以分离血细胞、血浆和其他细胞外囊泡。常用的离心方法包括低速离心和高速离心。低速离心（如500×g，10分钟）可将血细胞和血浆分离；高速离心（如10,000×g，30分钟）可进一步分离血浆中的细胞外囊泡。四、收集血浆：将离心后的血液分层，用吸管或移液器小心地收集上层的血浆层。血浆中含有丰富的蛋白质、生长因子、激素等生物活性物质。五、蛋白酶抑制剂处理：先向血浆样品...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷朋举，孙嘉骏，赵庆云，焦煜淞，高赞，李旭泽，
申请(专利权)人：河北工程大学，
类型：发明
国别省市：
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