【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化学分析，具体而言，涉及一种高效液相色谱同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的方法。
技术介绍
1、杭白菊(chrysanthemum morifolium ramat)属于菊科，为多年生宿根亚灌木植物，是著名的浙江中药材“浙八味”之一。在医药方面，杭白菊具有镇静、解热、养肝、明目等多种药用价值，而现代医学证明，杭白菊同样具有抗炎、抗病毒、抗心血管疾病等作用。杭白菊一般于4—5月压枝分栽，在8月20日左右打顶后，随着气温降低和日照渐短，完成由营养生长向生殖生长的快速转变。与观赏菊不同，如使用人工补光和遮光手段调节花期，将极大增加生产成本。因此，研究成花期内源激素的动态变化，外源激素补充与花期调节，对杭白菊的种植推广和生产具有重要的意义。
2、植物内源激素(plant endogenous hormones)参与植物整个生命过程，对开花的影响非常重要。在特定的条件下，激素信号的调控往往是将不同激素信号汇集后通过改变关键开花基因的表达水平来实现。因此，对杭白菊成花期内源激素的含量变化进行研究，对弄清杭白菊内源激素在成花期中的可能作用机制具有重要作用，并且可以为开发和应用外源激素控制杭白菊成花提供指导。
3、早期植物激素的测定，基本都是采用生物测试方法，但因灵敏度和选择性不足，已逐渐被淘汰。气相色谱-质谱(gc-ms)和以单克隆抗体为基础的免疫法，都是现代植物激素检测的新技术，在gc-ms法中，选择性离子检测技术更加迅速有效，它不仅具有高的灵敏度，而且能准确鉴定激素的分子结构，但这些方法均须经冗长的
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种高效液相色谱同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的方法，在样本前处理过程中采用柠檬酸调节ph至酸性，再采用c18固相萃取小柱过滤，显著提升了样本中待测物质的回收率，再对高效液相色谱流动相和洗脱梯度进行优化，采用的流动相a为甲醇，流动相b为0.3～1.2％甲酸溶液，实现了杭白菊中的5种内源激素和1种外源激素的快速同时检测，并能显著提高检测灵敏度和准确度，既可以对杭白菊花芽分化等生长发育中内源激素的变化等进行确定，还可以为外源激素的补充提供指导，减少盲目补充外源激素的现象发生。
2、本专利技术所述的杭白菊中的内源激素为ga、aba、iaa、sa和me sa，外源激素为6-ba。
3、其中的外源激素6-ba为人为添加的激素，用于调节杭白菊的生长，为了考察6-ba的吸收情况，需要对其进行监测。
4、虽然很多植物中都有这些激素，但是不同激素在不同植物内的含量(数量级)是不一样的，而且小麦、水稻、大豆等无色素或无特殊物质的植物实验背景值较为干净，杭白菊有大量的生物碱、色素等干扰检测难度较大。
5、本专利技术的目的之一在于提供一种优化、简便的杭白菊内源激素测定的前处理方法，主要为固相萃取小柱c18小柱过滤，并在采用c18固相萃取小柱过滤前，先用柠檬酸调节ph至酸性；使用自制的避光玻璃管防止aba等激素见光分解，使用无水硫酸钠和-20℃结合去除水相(减少各种溶剂相互萃取造成的损失)，使用低温氮吹浓缩代替旋转蒸发(防止高温激素降解)。
6、本专利技术的目的之二在于提供一种同时检测杭白菊叶片中5种内源激素和1种外源激素的方法，采用高效液相色谱，色谱条件为：流动相a：色谱甲醇，流动相b：0.6％甲酸水溶液，梯度洗脱。采用高效液相色谱(hplc)分析可以提高测定的灵敏性、选择性，还可以减少冗长的样品纯化程序，降低实验成本。
7、一方面，本专利技术提供了一种同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的样本前处理的方法，所述方法包括采用c18固相萃取小柱过滤，并在上c18固相萃取小柱前先用柠檬酸调节ph至酸性。
8、进一步地，所述用柠檬酸调节ph时，需使ph调节至2.5～3.0。
9、进一步地，所述样本前处理包括在黑暗、低温条件下进行甲醇溶液提取，提取液经柠檬酸调节ph至2.5～3.0，再采用c18固相萃取小柱过滤。
10、进一步地，所述样本前处理包括：(1)将样品放入液氮中，在黑暗条件下破碎，加入甲醇溶液提取，离心取上清；(2)添加pvpp，取上清，用柠檬酸调节ph至2.5～3.0；(3)过c18固相萃取小柱过滤；(4)无水硫酸钠去除多余水分；(5)氮气吹干，甲醇复溶；(6)有机微孔滤膜过滤，待测。
11、另一方面，本专利技术提供了一种同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的方法，所述方法包括样本前处理，所述样本前处理包括采用c18固相萃取小柱过滤，并在上c18固相萃取小柱前先用柠檬酸调节ph至酸性。
12、杭白菊中的内源激素和外源激素含量非常低，而且干扰物较多，如色素、类黄酮等成分均会对检测结果产生严重干扰；另外由于杭白菊的内源激素aba对光敏感，sa遇热不稳定等原因，使样本前处理的过程更加繁琐复杂。因此杭白菊中的内源激素和外源激素的检测较困难，尤其是其中含量特别低的ga，非常容易出现漏检或错检的情况。
13、本专利技术通过改进样本前处理过程，使样本在上c18固相萃取小柱过滤前，先用柠檬酸调节ph至酸性，从而使样本中的内源激素和外源激素与杂质分离更彻底，显著提高了待测的内源激素和外源激素的回收率，尤其是提高了含量特别低的ga的回收率。
14、进一步地，经样本前处理后，需经高效液相色谱检测；所述高效液相色谱的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，流动相b为含0.3～1.2％的甲酸溶液。
15、本研究小组最初采用的流动相b为乙酸溶液，但是经实验证明，乙酸为流动相b时，虽然峰形较尖，但杂质和干扰峰也变化较大，而且不如甲酸体系稳定，因此优选流动相b为甲酸溶液。
16、进一步地，所述流动相b为0.6％的甲酸溶液。
17、本专利技术对流动相b(甲酸或乙酸)的不同浓度进行优化选择，选择出6％甲酸为最优，此时测得的峰高更高，然后进行了梯度模拟，发现最优的分析效果，进一步提高检测灵敏度。
18、进一步地，所述高效液相色谱的洗脱梯度如下所示：
19、
20、
21、梯度优化对于同时检测出杭白菊中的5种内源激素ga、aba、iaa、sa和mesa，和1种外源激素6-ba非常重要，因为5种内源激素中的aba和sa的峰靠得非常近，难以完全分开，需要经过对洗脱梯度尽量优化，才能使aba和sa完全分开，并且每种内源本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的方法，其特征在于，包括样本前处理，所述样本前处理包括采用C18固相萃取小柱过滤，并在上C18固相萃取小柱前先用柠檬酸调节pH至酸性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经样本前处理后，需经高效液相色谱检测；所述高效液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，流动相B为含0.3～1.2％的甲酸溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相B为0.6％的甲酸溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的洗脱梯度如下所示：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用柠檬酸调节pH时，需使pH调节至2.5～3.0。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样本前处理包括在黑暗、低温条件下进行甲醇溶液提取，提取液经柠檬酸调节pH至2.5～3.0，再采用C18固相萃取小柱过滤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样本前处理包括：(1)将样品放入液氮中，在黑暗条件下破碎，加入甲醇溶液提取，离心取上清；(2)添
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱采用C18柱，柱温35℃，检测器信号波长为254nm；所述内源激素包括GA、ABA、IAA、SA或MeSA中的任意一种或多种；所述外源激素为6-BA。
9.一种高效液相色谱同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的试剂盒，其特征在于，包括柠檬酸和高效液相色谱流动相；所述流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲醇，流动相B为含0.3～1.2％的甲酸溶液。
10.柠檬酸用于制备提高杭白菊中内源激素和/或外源激素的检测灵敏度的试剂的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测杭白菊中内源激素和外源激素的方法，其特征在于，包括样本前处理，所述样本前处理包括采用c18固相萃取小柱过滤，并在上c18固相萃取小柱前先用柠檬酸调节ph至酸性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经样本前处理后，需经高效液相色谱检测；所述高效液相色谱的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，流动相b为含0.3～1.2％的甲酸溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相b为0.6％的甲酸溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的洗脱梯度如下所示：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用柠檬酸调节ph时，需使ph调节至2.5～3.0。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样本前处理包括在黑暗、低温条件下进行甲醇溶液提取，提取液经柠檬酸调节ph至2.5～3.0，再采用c18固相萃取小柱过滤。
【专利技术属性】
技术研发人员：潘铖，温晓梅，何雪怡，钮羽群，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：
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