【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及烟酰胺单核苷酸的制备，特别涉及一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法。
技术介绍
1、β-烟酰胺单核苷酸，又称作β-nmn，其作为哺乳动物体内辅酶i——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)合成的关键前体之一，逐渐被研究者了解和研究。nad+对人体健康有着重要作用，参与上千种生物催化反应，其总含量随着年龄增加而逐渐减少。nmn是体内烟酰胺核糖(nr)转变为nad路径最重要的中间体，最新研究表明：口服nmn导致nad+回升，可使与人类接近的生物模型体系寿命延长30％以上。近年来，随着对nmn的研究逐渐深入，发现其具备多种生物功能，对心脑疾病、老年退行疾病、神经退行疾病、延缓衰老等有治疗作用，证明了nmn与衰老相关疾病具有显著相关性。当前中国营养健康产业规模已成为仅次于美国的第二大市场，因此nmn在医药治疗方面有着广泛的应用前景，同时也在营养健康产业方面有着广泛的市场前景。
2、传统的nmn的化学合成工艺产率和纯度较低，反应条件苛刻，对环境有一定污染。因此现有的nmn制备方法主要为生物合成法，该方法主要包括以下三种：1、从色氨酸起始的从头合成；2、烟酰胺或烟酸的补救途径合成途径；3、从nr转化合成途径。生物酶法合成nnm的研究中，工艺存在以下缺陷：一是原料合成收率低，且不易放大生产，原料来源受到限制；二是nmn的磷酸化反应需要在atp的存在下进行，由于atp价格昂贵，增加了nmn的生产成本。现有技术中nr反应转化率以及酶促反应中温度、酸碱度、酶的浓度、底物浓度、抑制剂、激活剂等的酶催体系有待提高，并且反应时间过长
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，在提高底物烟酰胺核糖浓度的同时保持较高的底物转化率的同时提高转化率和降低成本，并且大幅缩短所需的催化时间，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：
4、s1：构建烟酰胺核糖核苷激酶和多聚磷酸盐激酶的双酶表达菌株；
5、设计引物利用高保真酶扩增烟酰胺核苷激酶(np_733778.1homo sapiens nrk02，序列见seq id no.1、no.2)基因及多聚磷酸盐激酶(wp_011583516.1cytophagahutchinsonii ppk03，序列见seq id no.3、no.4)基因；根据酶切位点双酶切nrk基因、ppk基因、prsfduet1载体见图1，将prsfduet1载体骨架与ppk基因、nrk基因通过t4 dna连接酶连接得到nmn03，其余基因克隆操作具体可参考j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》；
6、s2：建立应用生物酶制备烟酰胺单核苷酸的酶促反应体系；
7、粗酶液的制备：将nmn03菌泥用0.01mol/l pb ph＝7.4缓冲液重悬，浓度为200g/l，重悬后搅拌至完全溶解，之后使用均质机进行破胞，重复三次，即得到粗酶液；
8、酶促反应体系配置：
9、取nr100-400mmol/l、2-2.5g/l atp-2na、偏磷酸盐40-90mmol/l、ph调节剂以及mg2+25-125mmol/l,nmn0315-30g/l的物质定溶，通过一锅式的方式进行反应。
10、进一步地，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾、六偏磷酸钾。
11、进一步地，所述的ph调节剂包括氨水和氢氧化钠，所述mg2+选自mgso4·7h2o，ph调节剂的ph为5.5。
12、进一步地，所述反应的温度为30-37℃。
13、进一步地，所述反应中溶液的转速为50-200r/min。
14、进一步地，所述反应的时间为5-10h。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
16、通过对nrk和ppk酶的酶促机理的研究，调整最终确定最适酶促反应条件，利用六偏磷酸盐代替atp作为磷酸基团供体，保持底物转化率不低于95％，并将反应时间从现有技术的20h以上大幅缩短至不超过8h，大大降低原料成本，操作简单，反应彻底，易实现产业化、规模化生产。
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1.一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾、六偏磷酸钾。
3.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述的pH调节剂包括氨水和氢氧化钠，所述Mg2+选自MgSO4·7H2O，pH调节剂的pH为5.5。
4.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述反应的温度为30-37℃。
5.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述反应中溶液的转速为50-200r/min。
6.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述反应的时间为5-10h。
【技术特征摘要】
1.一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾、六偏磷酸钾。
3.如权利要求1所述的一种应用生物酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述的ph调节剂包括氨水和氢氧化钠，所述mg2+选自mgso4·7h...
【专利技术属性】
技术研发人员：周浩，王苓，史玉龙，夏华跃，居虎军，
申请(专利权)人：安徽瑞邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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