【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及酰基-coa氧化酶及其应用。
技术介绍
1、γ-癸内酯(γ-decalactone)，是一个含有五元环的内酯化合物，为无色液体，呈愉快的椰子和桃子香气，是香料中应用较为广泛的一种内酷类化合物，可作为食品添加剂配制食品中的奶油、桃子、椰子等香味，是国际公认的安全的食品和药品添加剂。
2、γ-癸内酯是手性分子，从水果中提取的γ-癸内酯具有特定的立体结构，但大部分γ-癸内酯是(r)-异构体。通过研究发现，(r)-异构体和(s)-异构体由于空间构型的不同，其香气特征也有所差异。
3、目前，多使用人工合成的消旋的γ-癸内酯，因此很大程度上影响了配方气味的像真度。所以具有光学活性的γ-癸内酯在水果类香精调配中具有很好的应用前景。利用微生物转化法生产可以得到具有旋光活性和相对较纯的产物，这是化学合成所不具备的优势，且通过微生物法制备可以有效避免化学合成步骤繁多、工艺复杂、致毒致癌的原料残留的缺点，具有很高的实用价值。
4、生物转化法制备γ-癸内酯，以蓖麻油酸为例，蓖麻油酸通过酰基-coa氧化酶等一系列酶的作用经4步β-氧化，脱去8个碳，生成4-羟基癸酸，再在相应的脂肪酶和辅酶等的催化作用下由4位碳上的羟基和首位羧基脱水缩合得到具有光学活性的γ-癸内酯。
5、但生物转化法依然需要改进。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种酰基-coa氧化酶，以提高现有的酰基-coa氧化酶的转化率，提高γ-癸内酯的产量。
2
3、在第一个方面，本专利技术提供一种酰基-coa氧化酶，其是将seq id no:40所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质，该蛋白质相比于未突变的seq id no:40所示的野生型酰基-coa氧化酶具有提高的转化率。
4、在一些实施方案中，上述酰基-coa氧化酶中，所述酰基-coa氧化酶是在seq idno:40所示的氨基酸序列的第146、222、285、370、493和/或572位进行氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；
5、在优选的实施方式中，所述氨基酸残基的取代为s146v、d222e、d222a、e285a、e285k、e285v、e370k、e370a、e370l、d493a、d493g、t572h、t572k、t572r中的一个或多个；
6、在优选的实施方式中，上述酰基-coa氧化酶的氨基酸序列如seq id no:21、seqid no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seqid no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seqid no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38或seq id no:39所示。
7、在一些实施方案中，上述酰基-coa氧化酶中，除了在第146、222、285、370、493和/或572位发生上述突变之外，其进一步可以在其他位点上具有氨基酸的保守取代，使得突变后的氨基酸比seq id no:40所示的酰基-coa氧化酶具有更加优异的底物特异性。优选地，所述氨基酸的保守取代保留本专利技术酰基-coa氧化酶变体的底物特异性。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，所述保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。最常见的氨基酸互换有氨基酸g至a；a至g，s；v至i，l，a，t，s；i至v，l，m；l至i，m，v；m至l，i，v；p至a，s，n；f至y，w，h；y至f，w，h；w至y，f，h；r至k，e，d；k至r，e，d；h至q，n，s；d至n，e，k，r，q；e至q，d，k，r，n；s至t，a；t至s，v，a；c至s，t，a；n至d，q，h，s；q至e，n，h，k，r的互换，以及它们的相反的互换。与上述酰基-coa氧化酶变体的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的酰基-coa氧化酶变体，优选地同源性为70-99％之间，更优选地同源性为80-99％之间，更优选地同源性为90-99％之间，最优选地同源性为99％，也属于本专利技术的保护范围。
8、在第二个方面，本专利技术提供编码上述任一所述的酰基-coa氧化酶的核酸分子，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
9、在一些实施方案中，上述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
10、1)具有seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seqid no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq idno:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq idno:19或seq id no:20所示的核苷酸序列的核酸分子；
11、2)与1)限定的核酸分子杂交且编码上述任一所述的酰基-coa氧化酶的核酸分子；
12、3)与1)或2)限定的核酸分子具有90％以上的序列同一性且编码上述任一所述的酰基-coa氧化酶的核酸分子。
13、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
14、这里使用的术语“同一性”可以用肉眼或计算机软件(比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序)进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酰基-CoA氧化酶，为在SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的第146、222、285、370、493和/或572位进行氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；优选地，所述氨基酸残基的取代为S146V、D222E、D222A、E285A、E285K、E285V、E370K、E370A、E370L、D493A、D493G、T572H、T572K、T572R中的一个或多个；
2.一种核酸分子，编码权利要求1所述的酰基-CoA氧化酶；优选地，所述核酸分子为DNA或RNA；
3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述重组载体为克隆载体或表达载体。
4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组载体；优选地，所述重组细胞的宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，进一步优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BL21(DE3)plysS、酿酒酵母、假丝酵母、香气掷孢酵母或耶氏酵母。
5.一种酰基-CoA氧化酶的制备方法，为：
6.根据
7.权利要求1所述的酰基-CoA氧化酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞或其发酵产物、和/或权利要求5或6所述的方法制备得到的酰基-CoA氧化酶在制备γ-癸内酯中的应用。
8.一种制备γ-癸内酯的方法，包括使用权利要求1所述的酰基-CoA氧化酶催化底物蓖麻油酸，得到γ-癸内酯。
9.根据权利要求8所述的方法，包括发酵权利要求4所述的重组细胞，生成的酰基-CoA氧化酶催化蓖麻油酸。
10.根据权利要求9所述方法，其中，发酵时所用的发酵培养基的组成为：葡萄糖5～50g/L，玉米浆干粉10～200g/L，MgSO4·7H2O 0.5～6g/L，Na2HPO4 0.2～5g/L，KH2PO40.2～3g/L，吐温-80 1～10g/L，pH5～9；优选地，发酵培养基为：葡萄糖10g/L，玉米浆干粉100g/L，MgSO4·7H2O 2.4g/L，Na2HPO4 1.2g/L，KH2PO4 0.5g/L，吐温-80 4g/L，pH 6.5；
...【技术特征摘要】
1.一种酰基-coa氧化酶，为在seq id no:40所示的氨基酸序列的第146、222、285、370、493和/或572位进行氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；优选地，所述氨基酸残基的取代为s146v、d222e、d222a、e285a、e285k、e285v、e370k、e370a、e370l、d493a、d493g、t572h、t572k、t572r中的一个或多个；
2.一种核酸分子，编码权利要求1所述的酰基-coa氧化酶；优选地，所述核酸分子为dna或rna；
3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述重组载体为克隆载体或表达载体。
4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组载体；优选地，所述重组细胞的宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，进一步优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)、rosetta(de3)、bl21(de3)plyss、酿酒酵母、假丝酵母、香气掷孢酵母或耶氏酵母。
5.一种酰基-coa氧化酶的制备方法，为：
6.根据权利要求5所述的制备方法，包括：将含有权利要求3所述重组载体导入酵母菌中，优选地，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾子樊，吴计划，王竞辉，张德旸，孔令晓，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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