【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子检测领域，具体涉及一种基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法。
技术介绍
1、滚环扩增(rolling circle amplification,rca)反应起源于自然界中细菌质粒的滚环复制过程，是一种高保真的恒温核酸扩增技术(firea.,xu s.q.,proc.natlacad.sci.u.s.a.,1995,92,4641-4645.)。rca反应体系由模板链以及dna聚合酶组成，当目标分析物序列存在时，其通过碱基互补配对作用与模板链杂交，在聚合酶辅助下进行3’端延伸，生成一条包含成千上万个模板互补序列的dna长链，从而实现目标物输入的信号扩增(johne r.,mullerh.,rectora.,van-ranst m.,stevens h.,trends microbiol.,2009,17,205-211.)。通过对模板链进行简单的序列设计，rca技术可以用于不同分析物的高效检测，因而被广泛用于生物诊断与研究。然而由于其扩增效率有限，仅能实现线性的信号放大，这限制了rca策略在低丰度目标物分析中的应用。
2、自此，研究者们开发了一系列方法用于改善传统rca技术的扩增效率。其中超支化rca反应通过在体系中引入目标链与反义目标链，实现指数级信号扩增(lizardi p.m.,huang x.,zhu z.,bray-ward p.,thomas d.c.,ward d.c.,nat.genet.,1998,19,225-232.)。然而，这一方法需要复杂的序列设计及实验条件优化，以降低核酸探
3、i-r3脱氧核酶(deoxyribozyme,dnazyme)是一类含有保守序列的dna片段，其在辅因子存在下，可以在特定位点发生自剪切反应(gu h.,furukawak.,weinberg z.,berensond.f.,breaker r.r.,j.am.chem.soc.,2013,135,9121-9129)。也就是说，i-r3 dnazyme既具有类似于切刻酶的催化剪切活性，又具有较高的鲁棒性，其可以作为强有力的工具用于改善传统rca的信号放大效率，实现目标链的催化扩增。然而，dnazyme介导的自催化滚环扩增策略却很少有人研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于自催化滚环扩增(exponential rolling ringamplification,e-rca)反应的核酸分析方法，该策略扩增效率高、选择性好，有利于实现低丰度生物标志物的同时检测与胞内原位成像。
2、为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面提供一种基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法，其步骤如下：
4、(1)模板序列的设计：模板链(template)由a、b、c三个部分组成，其中a区域与目标物序列互补，b区域与i-r3 dnazyme序列互补，c区域与信号输出单元序列互补。
5、(2)模板链的合成：将模板链前体(pre-template，2μm)与引物链(primer，4μm)在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中进行慢退，形成含有切口结构的双链杂交体，加入连接酶(t4 dnaligase，4u/μl)进行16℃过夜孵育，生成连接产物(ligation product)，接着将ligation product转移至含有外切酶i(exo i，0.5u/μl)和外切酶iii(exo iii，1u/μl)的甘氨酸缓冲液中，在37℃孵育2h，得到对应的模板链(template)；
6、上述方法中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液浓度为50mm，ph为7.5，含10mm mgcl2、1mmatp以及10mm dtt，所述的甘氨酸缓冲液浓度为67mm，ph为9.5，含6.7mmmgcl2以及10mmβ-me。
7、(3)基于自催化滚环扩增反应实现dna的检测：其模板链前体(pre-template0)以及引物链(primer0)的核苷酸序列如seq id no：1、5所示，在三羟基氨甲烷醋酸盐缓冲液中，将模板链(template0，40nm)、dntp(100μm)、phi29聚合酶(0.6u/μl)、乙酸锌(0.5mm)与目标dna(primer0)进行混合，在30℃孵育2h，随后加入2×sybr green i染料，并使用荧光定量pcr仪进行荧光强度检测；
8、或者，
9、基于自催化滚环扩增反应实现mirna的检测：在三羟基氨甲烷醋酸盐缓冲液中，将模板链(template，40nm)、dntp(100μm)、phi29聚合酶(0.6u/μl)、乙酸锌(0.5mm)与目标mirna进行混合，在30℃孵育2h，随后加入分子信标(beacon，200nm)，混合液在90℃保持3min，接着快速降温至25℃并保持2h，并使用荧光光谱仪进行输出信号检测；
10、上述方法中，所述的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液浓度为33mm，ph为7.9，含10mm mg-acetate、66mm k-acetate、0.1％(v/v)tween 20以及1mm dtt。
11、进一步地，本专利技术提供一种microrna-21(mir-21)的检测方法，其模板链前体(pre-template21)、引物链(primer21)以及分子信标(beacon21)的核苷酸序列如seq id no：3、6、8所示。
12、进一步地，本专利技术提供一种microrna-155(mir-155)的检测方法，其模板链前体(pre-template155)、引物链(primer155)以及分子信标(beacon155)的核苷酸序列如seq idno：4、7、9所示。
13、进一步地，本专利技术还提供上述自催化滚环扩增反应的mirna检测方法在细胞成像中的应用，其具体为：将200μl含有模板链(template21与template155，0.25nmole)以及20％甲酰胺的2×ssc与细胞进行37℃孵育1h，清洗并脱水后，在细胞培养皿中加入200μl含dntp(100μm)、phi29聚合酶(0.6u/μl)以及乙酸锌(0.5mm)的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液，进行30℃孵育2h，清洗并脱水后，在细胞培养皿中加入200μl含有报告链(reporter21与reporter155，100nm)以及20％甲酰胺的2×ssc，进行37℃孵育30min，使用5μg/mlhoechst93342对细胞核进行染色，最终用于共聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于自催化滚环扩增的核酸分析方法，其特征在于，所述的核酸为miRNA-21与miR-155，其Pre-template0、Pre-templateMT、Pre-template21、Pre-template155、Primer0、Primer21、Primer155、Beacon21、Beacon155、Reporter21、Reporter155的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-11所示。
3.权利要求1或2所述的基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法在胞内两种miRNA同时成像的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将200μL含有模板链(Template21与Template155，0.25nmole)以及20％甲酰胺的2×SSC与细胞进行37℃孵育1h，清洗并脱水后，在细胞培养皿中加入200μL含dNTP(100μM)、phi29聚合酶(0.6U/μL)以及乙酸锌(0.5mM)的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液，进行30℃孵育2h
5.一种基于自催化滚环扩增反应的DNA检测试剂盒，其特征在于，包含合成模板链Template0所需的Pre-template0链与Primer0链、T4 DNA连接酶、Exo I、Exo III、phi29聚合酶、乙酸锌。其中Pre-template0链与I-R3 DNAzyme序列互补，其5’端修饰磷酸基团，目标物Primer0链与Pre-template0链的5’及3’端各15个碱基互补。
6.一种基于自催化滚环扩增反应的miRNA检测试剂盒，其特征在于，当目标物miRNA为miR-21序列时，其包含合成模板链Template21所需的Pre-template21链与Primer21链、T4DNA连接酶、Exo I、Exo III、phi29聚合酶、乙酸锌以及分子信标Beacon21。其中Pre-template21链与I-R3 DNAzyme及miR-21的串联体序列互补，其5’端修饰磷酸基团，引物链Primer21与Pre-template21链的5’及3’端各18个碱基互补，Beacon21为茎环结构，其5’端与3’端分别修饰FAM以及BHQ-1基团，茎部可以被miR-21及miR-21扩增链识别并打开，输出FAM荧光信号；当目标物miRNA为miR-155序列时，其包含合成模板链Template155所需的Pre-template155链与Primer155链、T4 DNA连接酶、Exo I、Exo III、phi29聚合酶、乙酸锌以及分子信标Beacon155。其中Pre-template155链与I-R3 DNAzyme及miR-155的串联体序列互补，其5’端修饰磷酸基团，引物链Primer155与Pre-template155链的5’及3’端各20个碱基互补，Beacon155为茎环结构，其5’端与3’端分别修饰Cy5以及BHQ-3基团，茎部可以被miR-155及miR-155扩增链识别并打开，输出Cy5荧光信号。
...【技术特征摘要】
1.一种基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于自催化滚环扩增的核酸分析方法，其特征在于，所述的核酸为mirna-21与mir-155，其pre-template0、pre-templatemt、pre-template21、pre-template155、primer0、primer21、primer155、beacon21、beacon155、reporter21、reporter155的核苷酸序列如seq id no：1-11所示。
3.权利要求1或2所述的基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法在胞内两种mirna同时成像的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将200μl含有模板链(template21与template155，0.25nmole)以及20％甲酰胺的2×ssc与细胞进行37℃孵育1h，清洗并脱水后，在细胞培养皿中加入200μl含dntp(100μm)、phi29聚合酶(0.6u/μl)以及乙酸锌(0.5mm)的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液，进行30℃孵育2h，清洗并脱水后，在细胞培养皿中加入200μl含有报告链(reporter21与reporter155，100nm)以及20％甲酰胺的2×ssc，进行37℃孵育30min，使用5μg/mlhoechst 93342对细胞核进行染色，最终用于共聚焦成像。
5.一种基于自催化滚环扩增反应的dna检测试剂盒，其特征在于，包含合成模板链template0所需的pre-template0链与primer0链、t4 dna连接酶、exo i、exo iii、phi29聚...
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