【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用，属于生物。
技术介绍
1、西柏三烯一醇(cbt-ol)是烟草表皮腺毛分泌物的主要成分，为烟草西柏烷类化合物。在烟叶生长和调制过程中，西柏烷类化合物可降解为茄酮、氧化茄酮等香味成分，这些降解产物对于提高烟叶品质、增加卷烟香气、凸显卷烟风格特征具有重要积极影响。相关研究表明，西柏三烯一醇具有良好的抗真菌以及抗病毒活性，可作为药物前体用来合成高价值药物。西柏三烯一醇还具有良好的杀虫活性，当烟草害虫对烟草植株表面破坏时，包含在表面角质里的西柏三烯一醇就会被释放出来从而保护植株免受害虫的侵害，对烟草起到保护作用。西柏三烯一醇具有易于生物降解的特性，结合其杀虫活性可以作为环境友好的生物农药。因此西柏三烯一醇在烟草行业、农业以及制药业具有极大的应用价值。
2、由于西柏三烯一醇在烟草中含量较少，传统的植物提取方式不仅工艺复杂，且需要从烟叶中提取，来源受限，成本高昂无法满足市场的需求。化学合成法产量极低，目前不能用于工业化规模合成。而采用生物合成法生产西柏三烯一醇，能够弥补上述方法的不足，具有合成周期短、原料来源简单且容易规模放大的优点，因此高效绿色的生物合成是西柏三烯一醇等天然产物的主要制备途径。目前相关文献报道西柏三烯一醇生物合成产量较低，其中schrepfer等人以大肠杆菌为底盘细胞，在过表达dxp途径的基础上引入来自烟草的西柏三烯一醇合酶以合成西柏三烯一醇，但是5l发酵罐发酵5天产量仅为120mg/l；yang等人同样以大肠杆菌为底盘细胞，利用来自pantoe
3、西柏三烯一醇作为萜类化合物，其生物合成途径主要包括1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate，dxp)、甲羟戊酸途径(mevalonate，mva)以及异戊烯醇利用途径(isopentenol utilization pathway，iup)等，它们均是首先合成萜类化合物的通用前体物：异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，ipp)和它的异构体二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，dmapp)，进而在香叶基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase，gpps)、法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphatesynthase，fpps)以及香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，ggpps)催化作用下生成香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，ggpp)，最后由西柏三烯一醇合酶将ggpp转化为西柏三烯一醇。
4、利用mva或dxp途径合成西柏三烯一醇存在碳元素和能量利用低、合成效率低且酶的表达需要复杂调控等问题，限制着西柏三烯一醇的高效率合成。相对于mva或dxp途径，iup途径在上述问题中具有明显优势，该途径在合成ipp以及dmapp过程中只包含两个反应步骤，催化异戊烯醇仅需两分子atp并且碳摩尔转化效率为1.0，在萜类天然产物的生物合成中表现出巨大潜力及广阔的应用场景。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用，本专利技术通过基因工程手段系统构建了一株高产、高效率、低成本合成西柏三烯一醇的工程菌株，以促进其在农业以及烟草领域的应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌，通过敲除大肠杆菌宿主中乳酸脱氢酶编码基因ldha、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflb、磷酸转乙酰酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因acka和乙醛脱氢酶编码基因adhe，构建大肠杆菌工程菌株cbt05；分别构建重组表达载体plni、phtx、phbi，将构建的重组表达载体plni、phtx、phbi，以质粒共转化方式转入大肠杆菌工程菌株cbt05中，构建共同过表达羟乙基噻唑激酶ecthim、异戊烯基磷酸激酶mthipk、异戊烯基二磷酸δ-异构酶scidi、双功能二磷酸法呢基合酶scerg20、香叶基香叶基二磷酸合酶tcggpps、西柏三烯一醇合酶ntcbts六种酶的大肠杆菌工程菌株cbt06。
4、一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
5、首先敲除大肠杆菌宿主中乳酸脱氢酶编码基因ldha、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflb、磷酸转乙酰酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因acka和乙醛脱氢酶编码基因adhe，构建大肠杆菌工程菌株cbt05；分别构建重组表达载体plni、phtx、phbi，将构建的重组表达载体plni、phtx、phbi，以质粒共转化方式转入大肠杆菌工程菌株cbt05中，构建共同过表达羟乙基噻唑激酶ecthim、异戊烯基磷酸激酶mthipk、异戊烯基二磷酸δ-异构酶scidi、双功能二磷酸法呢基合酶scerg20、香叶基香叶基二磷酸合酶tcggpps、西柏三烯一醇合酶ntcbts六种酶的大肠杆菌工程菌株cbt06。
6、其中，大肠杆菌工程菌株cbt05的构建方法，包括如下步骤：
7、(1)乳酸脱氢酶编码基因ldha的敲除
8、以大肠杆菌工程菌株escherichia coli bl21(de3)基因组为模板，设计供体dna，构建敲除ldha基因的大肠杆菌工程菌株cbt01；
9、(2)丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflb的敲除
10、以大肠杆菌工程菌株cbt01基因组为模板，设计供体dna，构建敲除pflb基因的大肠杆菌工程菌株cbt02；
11、(3)磷酸转乙酰酶编码基因pta的敲除
12、以大肠杆菌工程菌株cbt02基因组为模板，设计供体dna，构建敲除pta基因的大肠杆菌工程菌株cbt03；
13、(4)乙酸激酶编码基因acka的敲除
14、以大肠杆菌工程菌株cbt03基因组为模板，设计供体dna，构建敲除acka基因的大肠杆菌工程菌株cbt04；
15、(5)乙醛脱氢酶编码基因adhe的敲除
16、以大肠杆菌工程菌株cbt04基因组为模板，设计供体dna，构建敲除adhe基因的大肠杆菌工程菌株cbt05。
17、所述的高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌的构建方法，通过构建重组表达载体plni、phtx、phbi，并通过质粒共转化构建大肠杆菌工程菌株，包括如下步骤：
18、(1)构建含有羟乙基噻唑激酶编码基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除大肠杆菌宿主中乳酸脱氢酶编码基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB、磷酸转乙酰酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因ackA和乙醛脱氢酶编码基因adhE，构建大肠杆菌工程菌株CBT05；分别构建重组表达载体pLNI、pHTX、pHBI，将构建的重组表达载体pLNI、pHTX、pHBI，以质粒共转化方式转入大肠杆菌工程菌株CBT05中，构建共同过表达羟乙基噻唑激酶EcThiM、异戊烯基磷酸激酶MthIPK、异戊烯基二磷酸δ-异构酶ScIDI、双功能二磷酸法呢基合酶ScERG20、香叶基香叶基二磷酸合酶TcGGPPS、西柏三烯一醇合酶NtCBTS六种酶的大肠杆菌工程菌株CBT06。
2.一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌株CBT05的构建方法，包括如下步骤：
4.如权利要求2所述的高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，通过构建重组表达载体pLNI
5.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌在发酵生产西柏三烯一醇中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在含有50mL TB培养基的摇瓶中，添加终浓度为0.25mM的IPTG以及2.5g/L的异戊烯醇发酵合成西柏三烯一醇。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在5L的发酵罐中添加2.5L的TB培养基，终浓度为0.25mM的IPTG以及5.0g/L的异戊烯醇发酵合成西柏三烯一醇。
...【技术特征摘要】
1.一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除大肠杆菌宿主中乳酸脱氢酶编码基因ldha、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflb、磷酸转乙酰酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因acka和乙醛脱氢酶编码基因adhe，构建大肠杆菌工程菌株cbt05；分别构建重组表达载体plni、phtx、phbi，将构建的重组表达载体plni、phtx、phbi，以质粒共转化方式转入大肠杆菌工程菌株cbt05中，构建共同过表达羟乙基噻唑激酶ecthim、异戊烯基磷酸激酶mthipk、异戊烯基二磷酸δ-异构酶scidi、双功能二磷酸法呢基合酶scerg20、香叶基香叶基二磷酸合酶tcggpps、西柏三烯一醇合酶ntcbts六种酶的大肠杆菌工程菌株cbt06。
2.一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：王光路，李乾，杨雪鹏，常晋，魏新铎，张展，杨金初，徐永明，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：
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