厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法，本申请的无细胞反应方法首先根据脱卤酶TmrA的生产条件特异性的配制无细胞反应体系，反应体系能满足脱卤酶TmrA的生产；此外，针对脱卤酶TmrA的生产需要厌氧环境的条件，设计了专用的反应容器，反应容器中采用氮气曝气搅拌的方式，满足了厌氧的反应条件；此外，反应器中利用透析膜将反应器分成了“反应区”和“缓冲液区”在反应器中，反应完成后，废液透析到缓冲液区，有效延长了蛋白反应时间，降低废液对蛋白反应的影响，有效提升了蛋白的产量。

【技术实现步骤摘要】

【】本专利技术涉及生物，特别涉及厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法。

技术介绍

0、
技术介绍

1、无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。它以外源mrna或dna为模板在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质。随着生物组学时代的到来无细胞蛋白质合成系统显示出快速、方便、易于高通量等优点，通常的蛋白表达是用细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等表达系统表达外源基因的一种分子生物学技术。该技术的出现极大促进了生物制品领域的发展，生产出了多种应用于人和动物疾病诊断和治疗的生物制品，保障了人和动物的生命健康。

2、大肠杆菌是一种典型的革兰氏阴性菌原核表达系统，也是最有效的异源蛋白生产者之一。利用该系统表达蛋白质是最简单、最快速和最便宜的。迄今为止，经过改造的大肠杆菌因其生长速度快(短至20～30min)，较强的连续发酵能力和相对较低的成本，已经成为广泛用于表达外源蛋白的宿主。目前有许多不同n末端和c末端标签的表达载体，并且针对特殊应用也正在优化许多不同的菌株。但是现在使用大肠杆菌作为无细本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.无细胞反应体系，其特征在于，所述无细胞反应体系共20ml，包括如下成分：1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为4％的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液和5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。

2.根据权利要求1所述的无细胞反应体系，其特征在于，所述带有目的基因的重组质粒制备方法为：以T7p14-deGFP质粒为模板，采用NcoI和XhoI酶对质粒...

【技术特征摘要】

1.无细胞反应体系，其特征在于，所述无细胞反应体系共20ml，包括如下成分：1.2mm的atp和1.2mm的gtp、0.8mm的ctp、0.8mm的utp、30mm的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mm、1mm的醋酸镁、3mm的二谷氨酸钾、质量百分浓度为4％的peg 8000、5ml的lobstr-bl21(de3)-ri的大肠杆菌细胞裂解液和5nm带有目的基因的重组质粒t7cf_8his-mcherry-tmra。

2.根据权利要求1所述的无细胞反应体系，其特征在于，所述带有目的基因的重组质粒制备方法为：以t7p14-degfp质粒为模板，采用ncoi和xhoi酶对质粒进行酶切，然后接入荧光蛋白基因8his-mcherry和目的基因tmra，即得重组质粒t7cf_8his-mcherry-tmra；所述目的基因tmra的基因序列如seq id no.1所示。

3.一种应用如权利要求1或2所述无细胞反应体系生产tmra酶的方法，其特征在于，所述方法为：

4.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无细胞反应体系在蛋白反应器中进行反应，所述蛋白反应器从内到外依次为反应区和缓冲液区；所述反应区的由透析膜完全包裹形成；所述蛋白反应器还设有搅拌装置，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚青，苏子茗，林雅诗，张健，覃程荣，王双飞，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：