【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及经修饰的白细胞介素p40亚基蛋白质(包括融合蛋白质，特别是il12p40和il23p40)，或具有经修饰以降低白细胞介素细胞因子结合活性的p40亚基蛋白质的任何其他细胞因子；包含它们的组合物以及使用该组合物治疗包括癌症在内的多种疾病的方法。
技术介绍
1、白细胞介素12(il12)是异二聚体细胞因子家族的第一个公认成员，该家族包括il12、il23、il27、il35和il39。il12和il23分别是对t辅助细胞1(th-1)和t辅助细胞17(th-17)t细胞亚群的发育很重要的促炎细胞因子，而il27和il35是强效的抑制性细胞因子。il39是调节先天性和/或适应性免疫反应的重要细胞因子。il12可以直接增强效应cd4和cd8 t细胞以及自然杀伤(nk)和nk t细胞的活性。
2、il12是一种异二聚体分子，其由通过二硫键桥共价连接从而形成具有生物活性的70kda二聚体的α链(p35亚基)和β链(p40亚基)构成。il23是il12细胞因子家族的成员，并且也由两个亚基构成：il23与il12共享的p40亚基、和p19。il-23具有与il-12相同的链il-12p40。p40亚基也以游离单体和二硫键连接的同型二聚体(p80)的形式分泌，该游离单体和二硫键连接的同型二聚体通常具有与il12和il-23的功能相拮抗的功能。il12受体或受体复合物由il12rβ1和il12rβ2构成。il23受体复合物(il23r)由il23r亚基和il12rβ1亚基组成，il12rβ1亚基是il12受体的常见亚基并且与酪氨
3、在生物学上，il12是包括吞噬细胞、b细胞和激活的树突细胞在内的多种免疫系统细胞响应于感染而产生的炎性细胞因子(colombo和trinchieri(2002),cytokine andgrowth factor reviews,13:155-168和hamza等人,“interleukin-12a keyimmunoregulatory cytokine in infection applications”int.j.mol.sci.11；789-806(2010)。il12在介导免疫系统先天性臂和适应性臂的相互作用、作用于t细胞和自然杀伤(nk)细胞、增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和活性以及其他炎性细胞因子(尤其是干扰素-γ(ifn-γ或ifnγ))的产生中发挥重要作用。
4、il12已在人体临床试验中作为用于治疗多种癌症(包括肾癌、结肠癌和卵巢癌、黑色素瘤和t细胞淋巴瘤)的免疫治疗剂(atkins等人(1997),clin.cancer res.,3:409-17；gollob等人(2000),clin.cancer res.,6:1678-92；hurteau等人(2001),gynecol.oncol.,82:7-10；以及youssoufian,等人(2013)surgical oncology clinics ofnorth america,22(4):885-901)以及作为癌症疫苗的佐剂(lee等人(2001),j.clin.oncol.19:3836-47)进行了测试。然而，il12在作为重组蛋白质全身施用时是有毒的。trinchieri,adv.immunol.1998；70:83-243.为了在最大限度地降低il12的全身毒性的同时最大限度地提高il12的抗肿瘤作用，已提出il12基因疗法方法使肿瘤部位处产生细胞因子，从而在低血清浓度下实现il12的高局部水平。qian等人,cell research(2006)16:182-188；us专利公开20130195800。
5、由于il12是由α链(p35亚基)和β链(p40亚基)组成的异二聚体分子，因此具有生物活性的异二聚体的产生需要该两个亚基的同时表达。使用含有p40和p35亚基的双顺反子载体实现了重组il12表达，该p40和p35亚基被ires(内部核糖体进入位点)序列分隔从而允许从单个载体独立表达两个亚基。然而，ires序列的使用可能会损害蛋白质表达。mizuguchi等人,mol ther(2000)；1:376-382。此外，p40和p35亚基的不等表达可导致同二聚体蛋白质(例如p40-p40二聚体)形成，这些蛋白质可能对il12信号转导产生抑制作用。gillessen等人eur.j.immunol.25(1):200-6(1995)。
6、作为il12亚基的双顺反子表达的替代，已通过将p40和p35亚基与(gly4ser)3或gly6ser接头联接产生功能性单链il12融合蛋白质。lieschke等人,(1997),naturebiotechnology 15,35-40；lode等人,(1998),pnas 95,2475-2480。(这些形式的p40-接头-p35或p35-接头-p40 il12构型在本文中可称为“单链il12(scil12)”)。
7、人il12 p70(即p35和p40的二聚体)具有已报道的5-19小时的体内半衰期，在作为治疗性化合物施用时可导致显著的全身毒性。参见例如，car等人"the toxicology ofinterleukin-12:a review"toxicologic path.27:1,58-63(1999)；robertson等人"immunological effects of interleukin 12administered by bolus intravenousinjection to patients with cancer"clin.cancer res.5:9-16(1999)；atkins等人"phase ievaluation of intravenous recombinant human interleukin 12in patientswith advance malignancies"clin.cancer res.3:409-417(1997)。鼠类肿瘤治疗模型的临床前研究表明，全身施用il12后具有强大的抗肿瘤作用。然而，在人中，尝试全身施用重组il12则导致包括患者死亡在内的严重毒性和有限的功效。因此，本领域仍然需要改进对il12的体内递送形式的治疗性控制。
技术实现思路
1、本公开的一个方面提供了含有经修饰的p40结构域的细胞因子融合蛋白质，并且特别地提供了il12和il23融合蛋白质，其在本文本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经修饰的p40结构域，所述经修饰的p40结构域相对于SEQ ID NO:10中列出的野生型人成熟IL12 p40结构域序列包含一种或多种氨基酸取代，其中所述一种或多种氨基酸取代位于E45、D62和D161中的一个或多个位置处，并且其中所述氨基酸残基的编号基于SEQID NO:10中列出的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的经修饰的p40结构域，其中所述一个或多个位置处的所述一种或多种氨基酸取代是K、H、I、N、R或S取代，或其组合。
3.如权利要求1-2中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括E45K。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括D62H。
5.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括D62I。
6.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括D62N。
7.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨
8.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括D161S。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括E45K、D62H、D62I、D62N、D161R或D161S中两种或更多种取代的组合。
10.一种经修饰的p40结构域，所述经修饰的p40结构域相对于SEQ ID NO:10中列出的野生型人成熟IL12 p40结构域序列包含一种或多种氨基酸取代，其中所述一种或多种氨基酸取代为W15H、W15K、W15R、D18G、E45K、K58H、K58W、E59D、E59G、E59R、F60D、F60E、F60K、F60R、F60V、D62H、D62I、D62N、K84E、K84I、K84L、K84V、K84W、K84Y、E86L、E86R、E86S、E86W、D93E、D93H、D93R、D93W、D161R、D161S、K197D、K197E、K197Q、K197T或K197W，或其组合，并且其中所述氨基酸残基的编号基于SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域包含一种或多种、两种或更多种、或三种或更多种氨基酸取代。
12.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代为W15H、W15K、D18G、E45K、K58H、K58W、E59G、E59R、F60V、D62H、D62I、D62N、K84E、K84W、E86L、E86S、E86W、D93H、D93W、D161R、D161S、K197E、K197Q、K197T或K197W，或其组合。
13.如权利要求10-12中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代为W15H、W15K、E59R、K84E、K84W、E86W、D161R、K197T或K197W，或其组合。
14.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为W15H_K84L、K58H_K84I、E59D_K84W、E59G_K84W、E59R_K84E、E59R_K84W，E59R_E86W、E59D_D93H、E59R_D93R、E59R_K197E、E59R_K197W、F60E_K84W、F60R_K84Y、F60K_K197W、F60R_K197W、K84I_E86R、K84E_D93H、K84I_D93H、K84V_D93H、K84W_D93W、K84I_D161R、K84W_D161R、K84W_K197E、K84W_K197Q、K84W_K197W、E86W_D93E、E86R_K197D、E86W_K197W、W15H_K84L_K197Q、K58H_E86R_K197D、E59D_K84W_K197W、F60R_K84E_K197W、K84I_E86R_D93H或W15R_E59D_F60D_K197W，或其组合。
15.如权利要求14所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为W15H_K84L、E59D_D93H、E59R_D93R、F60K_K197W、F60R_K84Y、K84I_E86R、K84W_D161R、K84W_K197W、E86R_K197D、E86W_D93E、W15H_K84L_K197Q、K58H_...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经修饰的p40结构域，所述经修饰的p40结构域相对于seq id no:10中列出的野生型人成熟il12 p40结构域序列包含一种或多种氨基酸取代，其中所述一种或多种氨基酸取代位于e45、d62和d161中的一个或多个位置处，并且其中所述氨基酸残基的编号基于seqid no:10中列出的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的经修饰的p40结构域，其中所述一个或多个位置处的所述一种或多种氨基酸取代是k、h、i、n、r或s取代，或其组合。
3.如权利要求1-2中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括e45k。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括d62h。
5.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括d62i。
6.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括d62n。
7.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括d161r。
8.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括d161s。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代包括e45k、d62h、d62i、d62n、d161r或d161s中两种或更多种取代的组合。
10.一种经修饰的p40结构域，所述经修饰的p40结构域相对于seq id no:10中列出的野生型人成熟il12 p40结构域序列包含一种或多种氨基酸取代，其中所述一种或多种氨基酸取代为w15h、w15k、w15r、d18g、e45k、k58h、k58w、e59d、e59g、e59r、f60d、f60e、f60k、f60r、f60v、d62h、d62i、d62n、k84e、k84i、k84l、k84v、k84w、k84y、e86l、e86r、e86s、e86w、d93e、d93h、d93r、d93w、d161r、d161s、k197d、k197e、k197q、k197t或k197w，或其组合，并且其中所述氨基酸残基的编号基于seq id no:10中列出的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域包含一种或多种、两种或更多种、或三种或更多种氨基酸取代。
12.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代为w15h、w15k、d18g、e45k、k58h、k58w、e59g、e59r、f60v、d62h、d62i、d62n、k84e、k84w、e86l、e86s、e86w、d93h、d93w、d161r、d161s、k197e、k197q、k197t或k197w，或其组合。
13.如权利要求10-12中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代为w15h、w15k、e59r、k84e、k84w、e86w、d161r、k197t或k197w，或其组合。
14.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为w15h_k84l、k58h_k84i、e59d_k84w、e59g_k84w、e59r_k84e、e59r_k84w，e59r_e86w、e59d_d93h、e59r_d93r、e59r_k197e、e59r_k197w、f60e_k84w、f60r_k84y、f60k_k197w、f60r_k197w、k84i_e86r、k84e_d93h、k84i_d93h、k84v_d93h、k84w_d93w、k84i_d161r、k84w_d161r、k84w_k197e、k84w_k197q、k84w_k197w、e86w_d93e、e86r_k197d、e86w_k197w、w15h_k84l_k197q、k58h_e86r_k197d、e59d_k84w_k197w、f60r_k84e_k197w、k84i_e86r_d93h或w15r_e59d_f60d_k197w，或其组合。
15.如权利要求14所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为w15h_k84l、e59d_d93h、e59r_d93r、f60k_k197w、f60r_k84y、k84i_e86r、k84w_d161r、k84w_k197w、e86r_k197d、e86w_d93e、w15h_k84l_k197q、k58h_e86r_k197d、e59d_k84w_k197w、f60r_k84e_k197w、k84i_e86r_d93h或w15r_e59d_f60d_k197w，或其组合。
16.如权利要求14所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为k58h_k84i、e59d_k84w、e59g_k84w、e59r_e86w、e59r_k197e、e59r_k197w、e59r_k84e、e59r_k84w、f60e_k84w、f60r_k197w、k84e_d93h、k84i_d161r、k84i_d93h、k84v_d93h、k84w_d93w、k84w_k197e、k84w_k197q或e86w_k197w，或其组合。
17.如权利要求14所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为w15h_k84l、k58h_k84i、e59d_k84w、e59g_k84w、e59r_k84e、e59r_k84w、e59r_e86w、e59d_d93h、e59r_d93r、e59r_k197e、e59r_k197w、f60e_k84w、f60r_k84y、f60k_k197w、f60r_k197w、k84i_e86r、k84e_d93h、k84i_d93h、k84v_d93h、k84w_d93w、k84i_d161r、k84w_d161r、k84w_k197e、k84w_k197q、k84w_k197w、e86w_d93e、e86r_k197d或e86w_k197w，或其组合。
18.如权利要求14所述的经修饰的p40结构域，其中所述两种或更多种氨基酸取代为w15h_k84l、e59d_d93h、e59r_d93r、f60k_k197w、f60r_k84y、k84i_e86r、k84w_d161r、k84w_k197w、e86r_k197d或e86w_d93e，或其组合。
19.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述三种或更多种氨基酸取代为w15h_k84l_k197q、k58h_e86r_k197d、e59d_k84w_k197w、f60r_k84e_k197w、k84i_e86r_d93h或w15r_e59d_f60d_k197w，或其组合。
20.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述一种或多种氨基酸取代选自表c。
21.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域包含与seq id no:12-14、16、18、19、21-34和36-56中任一项中列出的氨基酸序列具有至少约90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
22.如权利要求10-11中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域包含选自以下的氨基酸取代或氨基酸取代集合：w15r_e59d_f60d_k197w、w15h_k84l_k197q、e59d_k84w_k197w、k58h_e86r_k197d、w15h_k84l、f60r_k84e_k197w、k84w_k197w、f60k_k197w、e86r_k197d、k84i_e86r_d93h、e59r_d93r、k84i_e86r、w15k、k84w_d161r、e45r_k58s_e59s_k195d、e59d_d93h、f60r_k84y、e86w_d93e、k58s_e59s_k195d、k84e、k197t、e59r、w15h、k84w、k197w、e59s、d161r或e86w，或其组合。
23.如权利要求22所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域包含选自以下的氨基酸取代或氨基酸取代集合：w15h_k84l_k197q、e59d_k84w_k197w、k84w_k197w、f60k_k197w、e59r_d93r、w15k或f60r_k84y，或其组合。
24.如权利要求1-23中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域与其同源受体中的至少一种同源受体的结合亲和力相对于具有seq id no:10中列出的序列的未修饰的野生型p40结构域的所述结合亲和力并且如在报告基因测定(rga)中所确定降低约5倍至约1000倍、约5倍至约800倍、约5倍至约600倍、约10倍至约500倍、约10倍至约300倍或约20倍至约200倍。
25.如权利要求24所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域与其同源受体中的至少一种同源受体的结合亲和力降低约20倍至约200倍。
26.如权利要求24-25中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述至少一种同源受体包含il12rβ1。
27.如权利要求1-26中任一项所述的经修饰的p40结构域，其中所述经修饰的p40结构域的如通过解链温度测量的热稳定性在具有seq id no:10中列出的序列的未修饰的野生型p40结构域的热稳定性的±5℃、±4℃、±3℃、±2℃或±1℃内，并且其中所述解链温度通过差示扫描荧光法(dsf)或差示扫描量热法(dsc)来确定。
28.一种il12融合蛋白质，其包含权利要求1-27中任一项所述的经修饰的p40结构域。
29.一种il12融合蛋白质，其包含il12多肽，其中所述il12多肽包含
30.如权利要求29所述的il12融合蛋白质，其中所述p35结构域包含与seq id no:11中列出的氨基酸序列具有至少约90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
31.如权利要求30所述的il12融合蛋白质，其中所述p35结构域的n末端直接地或经由第一接头偶联到所述经修饰的p40结构域的c末端。
32.如权利要求31所述的il12融合蛋白质，其中所述第一接头具有(g4s)x的序列，并且其中x是1、2、3或4。
33.如权利要求29-32中任一项所述的il1...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·布莱克勒，T·斯普雷特·冯克罗登斯泰恩，
申请(专利权)人：酵活英属哥伦比亚有限公司，
类型：发明
国别省市：
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