【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学传感器领域，具体涉及一种杂化酶级联拟酶修饰电极及制备方法和有机磷农药的检测方法。
技术介绍
1、有机磷农药(organophosphorus pesticides，ops)是一类以磷元素为核心结构的农药，具有广谱、高效和成本低廉等优势，被广泛应用于果蔬等农产品的生产。然而，在实际应用中存在不科学的使用方法及混配问题，导致农产品中有机磷农药残留严重。
2、现如今有机磷农药残留的检测方法主要有两类，传统仪器检测分析技术和快速检测法。常规的仪器检测方法主要集中在气相色谱法、色谱-质谱联用法和高效液相色谱法等色谱法以及免疫学法和酶抑制法等。虽然色谱法有较高的灵敏度和稳定性，但常规的色谱-质谱检测等分析农药残留的技术成本较高、检测周期长，大多存在设备昂贵、溶剂消耗量大，难以在短期内实现大量样品的筛查及检测。免疫学法则存在样品前处理繁琐、操作复杂、检测耗时长及难以达到现场检测分析等缺点。为准确、便捷、实时快速地检测农药残留，许多快速检测方法也应运而生，其中之一就是酶抑制技术检测法，该方法是一种已经较为成熟的农药残留含量检测方法，其中最常用的是比色法，这种方法的精确度与灵敏度相对较高。但酶抑制法检测农残时，可以使用该方法进行检测的农药类型局限，极大限制了酶抑制分析在农残检测方面的应用。因此，迫切需要在此领域开展深入的研究工作建立快速、有效的方法检测有机磷农药的残留。如今利用电化学传感器对有机磷农药进行灵敏检测逐渐成为研究热点，其中电化学酶生物传感器将酶与底物相互作用并与电化学分析相结合，因其灵敏度高、选择性好、
3、目前基于电化学酶生物传感器法测定有机磷农药残留的专利研究主要集中于通过有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶(ache)活性，从而导致底物乙酰硫代胆碱(atch)水解生成硫代胆碱(tch)的含量减小，使得tch氧化后产生的电流强度减小。这一方法可以提高酶的固定效率、提高传感器的灵敏度、实现对有机磷农药残留量的灵敏检测。但该法中所利用的ache的成本较高，且对不同种类有机磷农药的测定存在一定的局限性，检测范围较小。同时，ache作为一种蛋白质会阻碍酶与电极之间的电子传递，影响传感器的灵敏度，会出现ache生物传感器的稳定性和选择性受损而引起的一系列问题。对于检测分析技术的建立，现有检测有机磷农药残留的方法成本高且检测范围较小、可检测农药的种类少，而利用价格低廉、来源广泛的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶并通过与金属盐溶液反应制得杂化脂肪酶，提高其稳定性实现对有机磷农药高性能的测定具有一定的可行性。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供一种杂化酶级联拟酶修饰电极及其制备方法，利用酶-无机杂化及拟酶级联技术制备组装修饰电极，构建酶基电化学传感分析体系，实现对食品中有机磷农药残留的快速、灵敏检测。
2、本专利技术所采用的技术方案如下：一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，步骤如下：
3、s1：按如下配比量：取体积为5ml、浓度为0.01～0.2mol/l、ph 6.0～10.0的pbs缓冲溶液，加入体积为1ml、酶活为23u/mg的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶和体积为200μl、浓度为0.1～0.4mol/l的znso4溶液，混合均匀后，再进行孵育、离心、洗涤、冻干，得到zn/hnf杂化脂肪酶；
4、s2：将浓度为1.0～3.0mg/ml的壳聚糖溶液和浓度为1.0～3.0mg/ml的zn/hnf杂化脂肪酶溶液按体积比1:1制得混合溶液，将5～25μl的所述的混合溶液滴涂于aunps@au电极表面，置于4℃干燥，得到aunps@zn/hnf@au修饰电极。
5、进一步的，如上所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的优选制备方法，步骤如下：
6、s1：按如下配比量：取体积为5ml、浓度为0.1mol/l、ph 8.0的pbs溶液，加入体积为1ml、酶活为23u/mg的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶和体积为200μl、浓度为0.3mol/l的znso4溶液，混合均匀后，再进行4℃孵育、离心、蒸馏水洗涤3次、冻干，得到zn/hnf杂化脂肪酶；
7、s2：将浓度为2.0mg/ml的壳聚糖溶液和浓度为2.0mg/ml的zn/hnf杂化脂肪酶溶液按体积比1:1制得混合溶液，将20μl的所述的混合溶液滴涂于aunps@au电极表面，置于4℃干燥12h，得到aunps@zn/hnf@au修饰电极。
8、进一步的，如上所述的aunps@au电极的制备方法如下：滴涂aunps溶液于裸金电极表面，置于4℃、干燥12h，制成aunps@au电极。
9、本专利技术的另一目的提供一种按如上所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法制得的一种杂化酶级联拟酶修饰电极。
10、本专利技术的另一目的是提供一种根据如上所述的杂化酶级联拟酶修饰电极得出的一种有机磷农药的检测方法，步骤如下：
11、s1：按如下配比量：以体积200μl，浓度为1,2,3…,12,单位：ng/l，建立不同浓度的有机磷农药的标准溶液，再分别与体积为3ml、浓度为0.1mol/l、ph 8.0的pbs缓冲溶液及aunps@zn/hnf@au修饰电极置于电化学专用瓶中，室温孵育20min，再分别加入体积为200μl、浓度为2mmol/l的棕榈酸对硝基苯酚溶液置于35℃水浴锅反应20min后，采用差分脉冲伏安法扫描，其中不含有有机磷农药时，即未经有机磷农药抑制的电流响应值为ipa0，含有有机磷农药抑制的电流响应值为ipa1，再根据抑制率公式：i＝(1-ipa1/ipa0)％，计算出不同浓度下有机磷农药的标准溶液的抑制率，从而构建出抑制率与不同浓度的有机磷农药之间线性关系的检测标准曲线：横坐标x为有机磷农药的浓度，纵坐标y为抑制率；
12、s2：按如下配比量：检测时，将体积为200μl的待测样品溶液与体积为3ml、浓度为0.1mol/l、ph8.0的pbs缓冲溶液以及aunps@zn/hnf@au修饰电极置于电化学专用瓶中，室温孵育20min；再加入体积为200μl、浓度为2mmol/l的棕榈酸对硝基苯酚溶液置于35℃水浴锅反应20min，采用差分脉冲伏安法扫描，从而检测aunps@zn/hnf@au修饰电极上产生的氧化峰电流，然后通过检测标准曲线得出待测样品溶液中有机磷农药的浓度。
13、进一步的，如上检测方法的所构建标准曲线所对应的有机磷农药检测的浓度范围为2.63×10-8mol/l～3.15×10-6mol/l。
14、进一步的，如上检测方法所述的有机磷农药包括甲基对硫磷、乐果、敌敌畏和马拉硫磷。
15、本专利技术的原理是基于制备一种新型的具有模拟过氧化物酶活性的杂化脂肪酶(zn/hnf)，通过增加酶的有效面积及杂化产生的过氧化物酶活性，提高脂肪酶的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，其特征在于，步骤如下：
3.根据权利要求3所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，其特征在于，所述的AuNPs@Au电极的制备方法如下：滴涂AuNPs溶液于裸金电极表面，置于4℃、干燥12h，制成AuNPs@Au电极。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法制得的一种杂化酶级联拟酶修饰电极。
5.根据权利要求4所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极得出的一种有机磷农药的检测方法，步骤如下：
6.根据权利要求5所述的一种有机磷农药的检测方法，其特征在于：所构建标准曲线所对应的有机磷农药检测的浓度范围为2.63×10-8mol/L～3.15×10-6mol/L。
7.根据权利要求5或6所述的一种有机磷农药的检测方法，其特征在于：所述的有机磷农药包括甲基对硫磷、乐果、敌敌畏和马拉硫磷。
【技术特征摘要】
1.一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，其特征在于，步骤如下：
3.根据权利要求3所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法，其特征在于，所述的aunps@au电极的制备方法如下：滴涂aunps溶液于裸金电极表面，置于4℃、干燥12h，制成aunps@au电极。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种杂化酶级联拟酶修饰电极的制备方法制...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈林林，吴松遥，李伟，李昕彤，郝熙，张铭，张海鹏，宋佳琪，张佳欣，
申请(专利权)人：哈尔滨商业大学，
类型：发明
国别省市：
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