【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及crispr基因座完全缺失cas1、cas2和cas4的可编程核酸酶及其应用。
技术介绍
1、crispr-cas系统最初来源于细菌的rna引导的适应性免疫系统，用于抵御包括噬菌体基因在内的入侵细菌的核酸成分。crispr是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，是由可以感染原核生物的噬菌体dna片段衍生来的，它可以检测并摧毁能引起相似感染的其他噬菌体中相似的dna，因此对原核生物抗噬菌体至关重要。cas蛋白是指crispr-associated蛋白，它是crispr系统中的相关蛋白。crispr基因座(crispr locus)由一个编码cas蛋白的操纵子及一个重复间隔序列(repeat spacer)构成，可以利用crispr序列中间隔序列(spacer)对应的rna指引，识别并且切割特定与其序列互补的dna链(r，b.，et al.，crispr providesacquired resistance against viruses in prokaryotes.science(new york，n.y.)，2007，315(5819)：p.1709-12.)。crispr/cas系统分为两大类，分别为class1和class2，区别在于第一大类中功能蛋白是由多个cas蛋白组成的，而第二大类系统中的功能蛋白是包含多结构域的单个蛋白质(kira s.makarova.，evolutio
2、crispr/cas9系统属于class 2，type ii型crispr系统，由cas9核酸酶、crrna及tracrrna组成，是目前使用最广泛的基因编辑工具；其简单高效，仅需要合成一段新的rna就可以实现基因编辑，其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点。crispr/cas9使基因编辑变得更快、更准确、更容易操作，也可以应用于包括人类医学、农业和生物燃料等多个方面，是一项具有社会颠覆性的技术。crispr-cas工具极大地加快了科学研究的脚步，而基于cas的生物技术的研发同样进步迅速。
3、目前，crispr/cas系统已从最初的crispr/cas9发展到现在的crispr/cas12a、crispr/cas13a等多种基因编辑系统。其中，crispr-cas12a是2类rna引导的核酸内切酶，可用于编辑哺乳动物基因组的crispr系统(zetsche b，gootenberg j s，abudayyeh o o，etal.cpf1 is a single rna-guided endonuclease of a class 2 crispr-cassystem.cell，2015，163(3)：759-771.)。crispr-cas12a(cpf1)，属于class2 type v，其尺寸较小，同时具备rna核酸内切酶和dna核酸内切酶的能力，能够识别富含胸腺嘧啶(t)的pam序列，扩展了crispr/cas系统的可编辑范围。常规的crispr-cas12位点(crispr locus)包括效应蛋白cas12蛋白，还有获得(adaptation)阶段相关蛋白cas4、cas1和cas2，如图1a图所示。cas1、cas2是目前crispr/cas系统中高度保守的蛋白，cas1具有核酸酶活性，而cas2并不具有核酸酶活性。cas1-cas2复合物的功能则是帮助整合prespacer进入crisprarray，而其中cas4负责完成pam序列的识别、移除，将捕获的外源dna片段加工至合适的长度，并促进spacer以正确的方向插入crispr阵列，对prespacer的选择、加工以及方向性整合非常关键(chunyi hu，et al.mechanism for cas4-assisted directional spaceracquisition in crispr-cas.nature volume 598，pages515-520 (2021))。而在部分含有cas1-cas2，不含有cas4的系统中，dnaq能够将含有pam和不含pam的dna链加工成标准长度进行整合反应，也就是dnaq执行类似cas4的功能(dongmei tang，et al.dnaq mediatesdirectional spacer acquisition in the crispr-cas system by a time-dependentmechanism.the innovation，volume 4，issue 5，2023.)。
4、crispr-cas12系统不仅拥有较好的靶向切割dna活性，同时还展现出显著区别于crispr-cas9的编辑特点。cas12a核酸酶扩大了基因编辑靶位点的选择范围，同时脱靶效应更低。相对于cas9核酸酶，cas12a核酸酶识别与crrna间隔区互补的dna靶序列，无需使用tracrrna。并且，cas12a蛋白酶分子量更小，更易进入细胞，编辑成功率更高。同时，cpf1这一系统通过识别富含t的pam并且在其靶向dna序列留下粘性末端从而产生基因编辑的效果，与cas9产生平末端相比，cas12a产生交错粘性末端可能更有利于以精确方向整合dna序列等应用。除cas12a是一个多功能蛋白，含有双链dna结合域和核酸酶域，cas12a靶向结合切割目标核酸的活性的同时，会附带激活旁切活性，即非特异性切割ssdna的酶切活性(s.y.li et al.，crispr-cas12a has both cis-and trans-cleavage activities onsingle-stranded dna.cell res 28，491-493(201 8).)。但传统的cas12a蛋白的基因编辑受前间区序列邻近基序(pam)的限制，只能识别部分核酸靶点，如lbcas12a倾向于识别含有tttv的pam序列；国际上广泛使用的是氨基酸球菌属cpf1(acidaminococcus cpf1，ascpf1)和毛螺菌科cpf1(lachnospiraceae cpf1，lbcpf1)，由于它们识别5′-tttn-3′的前间区序列邻近基序的灵活性不足，限制了其在基因编辑领域的应用。因此，需要发现新的cas12a蛋白，找到识别范围更广，更方便使用的新型cas12a蛋白酶。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中cas12a识别dsdna靶标序列pam范围受限的缺陷，通过宏基因数据挖掘发现有crispr位点不含本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CRISPR基因座完全缺失Cas1、Cas2和Cas4的可编程核酸酶，其特征在于，命名为Cpf1蛋白，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。
2.一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的Cpf1蛋白，以及一个或多个功能结构域。
3.一种编码权利要求1所述Cpf1蛋白或权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。
4.一种包含权利要求3所述多核苷酸的载体。
5.一种V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，其特征在于，包含权利要求1所述的Cpf1蛋白或编码权利要求1所述Cpf1蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，其特征在于，还包含CRISPRRNA；
7.权利要求1所述的Cpf1蛋白、权利要求2所述的融合蛋白、或权利要求3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的载体、或者权利要求5或6所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用。
8.一种基因编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒
10.一种核酸检测试剂盒，包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液；
...【技术特征摘要】
1.crispr基因座完全缺失cas1、cas2和cas4的可编程核酸酶，其特征在于，命名为cpf1蛋白，所述cpf1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2～5所示。
2.一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的cpf1蛋白，以及一个或多个功能结构域。
3.一种编码权利要求1所述cpf1蛋白或权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。
4.一种包含权利要求3所述多核苷酸的载体。
5.一种v型crispr/cas 12a基因编辑系统，其特征在于，包含权利要求1所述的cpf1蛋白或编码权利要求1所述cpf1蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的v...
【专利技术属性】
技术研发人员：石军超，丰媛媛，唐进，马培翔，黄行许，
申请(专利权)人：之江实验室，
类型：发明
国别省市：
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