【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体涉及一种基于dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法及应用。
技术介绍
1、重金属铅离子作为一种普遍存在于水、土壤和空气中的环境污染物。主要来源于工业废水排放、化学品使用和汽车尾气排放等渠道。此外，铅离子可以通过多种途径轻松进入陆地食物链，例如通过植物吸收，从而对人类造成潜在健康风险。长时间暴露于过量铅离子会导致许多健康问题，包括神经系统损伤、生殖异常和认知发育受损。鉴于铅离子对人类健康的严重威胁，重金属铅对人类健康和生态系统造成严重危害，尤其是对儿童和孕妇，其影响涉及神经系统、肾脏、血液和行为发育等多个方面。鉴于铅离子对人类健康的严重威胁，发展快速检测的分析方法变得至关重要。
2、现有技术已经建立了多种用于检测重金属铅离子的方法，例如包括原子吸收光谱法(aas)、电感耦合等离子体质谱(icp-ms)等，但是这些方法通常需要昂贵的设备、专业操作人员和长时间的实验流程，高成本投入和检测操作的专业要求限制了它们现场快速监测重金属离子的广泛适用性，并不能满足实时、便捷的监测需求。
3、dnazyme又称脱氧核酸酶，是一种由dna分子组成的催化剂，能够在特定条件下表现出催化活性。近年来，dnazyme基于dna的可编程性、可预测性和设计的灵活性等特点，使得dnazyme在医学诊断、生物传感等领域中得到广泛应用；尤其在重金属检测领域，dnazyme已经得到了广泛的应用。目前存在的dnazyme检测铅离子技术通常利用dnazyme作为识别工具，然后进行一系列核酸杂交、聚合和组装的生物传
4、另一方面，滚环扩增阳离子(rca)是一种等温dna扩增阳离子技术，不需要热循环和高变性温度，通过使用dna引物和dna聚合酶介导的环锁探针来实现。由于rca能够产生数千个重复序列，它已成功开发用于dna、蛋白质和小分子的高灵敏度检测。g-四联体是一种由富g核酸序列形成的独特的高阶结构，已被广泛用于构建生物传感器的功能工具。xiao-feng wang等(anal.methods，2018，10，3081)公开了一种通过多功能滚环扩增g-四联体检测pb(ii)的方法，mdp可作为靶标识别探针、催化dnazyme和滚环扩增(rca)引物。pb(ii)的存在可以诱导mdp的构象转换，导致mdp中的s-dna被裂解，释放出e-dna；释放的e-dna结合dna模板启动rca反应，以产生累积数量的重复序列。该技术方案中的rca产品被设计为一个富g序列，可以折叠成数千个四联体单元。由rca形成的g-四联体可以特异性地与nmm结合，导致荧光信号放大。通过这些级联放大，pb(ii)离子的检测值低至94.29pm。因此上述技术方案中报道的单g-四链体在重金属检测中表现出了良好的检测灵敏性。
5、因此，本专利技术基于上述技术的基础上，提出了一种将dnazyme与滚环扩增联用的方法进行铅离子的检测，通过将环状模板进行扩增后得到双g-四链体扩增产物一方面能够避免复杂的反应过程，另一方面能够更明显地提高了铅离子检测的灵敏度，大大提高了铅离子检测的检测限。
技术实现思路
1、有鉴于此，为解决上述问题，提供一种dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，以克服现有技术的不足。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种基于dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，包括采用dnazyme和滚环扩增联用的方法进行特异性的铅离子的定量或定性检测；所述滚环扩增产物为环状模板经滚环扩增后得到的双g-四链体；所述环状模板的序列如seq id no：3所示，且包含双g-四链体互补序列。
3、优选地，所述dnazyme由酶链和底物链组成；所述酶链包含滚环扩增的引物序列。
4、优选地，所述酶链的序列如seq id no：1所示。
5、优选地，所述底物链的序列如seq id no：2所示。
6、优选地，所述酶链、所述底物链和所述环状模板的添加的摩尔比为1∶1∶1。本专利技术中，分别以所述酶链、所述底物链和所述环状模板，通过dnazyme特异性地识别铅离子后，
7、优选地，将待测样本与所述dnazyme进行一次孵育后，加入、环状模板和扩增体系，进行二次孵育，得到所述滚环扩增产物，即双g-四链体；将所述滚环扩增产物与kcl、tht混合并进行反应，使所述双g-四链体具有荧光性，最后向最终反应产物中加入ddh2o，并进行荧光测量，得到铅离子含量。
8、具体地，上述的dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，包括以下步骤：
9、s1.提供dnazyme；
10、s2.在不同浓度的标准铅离子溶液分别与所述dnazyme进行一次孵育进行切割反应得到切割产物；
11、s3.将所述切割产物中加入环状模板和扩增体系，进行二次孵育，得到所述滚环扩增产物，即双g-四链体；
12、s4.将所述滚环扩增产物与kcl、tht混合并进行反应后，再加入ddh2o终止反应，并进行荧光测量，获得铅离子浓度与荧光强度的标准曲线；
13、s5.将含铅的待测样本加入至所述dnazyme中，重复s2～s4操作，并根据s3的所述标准曲线得到所述待测样本的铅含量。
14、优选地，s1中，所述dnazyme的制备方法包括使所述酶链、所述底物链与缓冲液的混合物于80℃反应5min，随后冷却至25℃反应40min，即得到所述dnazyme。
15、优选地，s2中，所述一次孵育的条件包括30℃下孵育1小时。
16、优选地，所述终止反应的条件包括，加入ddh2o并在65℃下加热10分钟，反应终止。
17、优选地，所述扩增体系包括t4 dna ligase、phi29 dna polymerase、t4 dnaligase缓冲液、phi29 dna polymerase缓冲液、dntp和水。
18、优选地，环状模板、t4 dna ligase、phi29 dna polymerase、t4 dna ligase缓冲液、phi29 dna polymerase缓冲液、dntp的添加体积比为1∶0.5∶0.5∶2∶2∶2。
19、优选地，所述t4 dna ligase的浓度为5u/μl。
20、优选地，所述连接酶缓冲液包括10×t4 dna ligase缓冲液。
21、优选地，所述phi29 dna polymerase的浓度为10u/μl。
22、优选地，所述聚合酶缓冲液包括10×phi29 dna polymerase缓冲液。
23、优选地，所述dntps的浓度为25mm。
24、基于以上技术方案，通过设计酶链、底物链和环状模板的序列结构，且无需标记，直接通本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，包括采用DNAzyme和滚环扩增联用的方法进行特异性铅离子的检测；
2.根据权利要求1所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，所述DNAzyme由酶链和底物链组成；所述酶链包含滚环扩增的引物序列。
3.根据权利要求2所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，所述酶链的序列如SEQ ID NO：1所示，所述底物链的序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，所述酶链、所述底物链和所述环状模板的添加的摩尔比为1∶1∶1。
5.权利要求1所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，将待测样本与所述DNAzyme进行一次孵育后，加入、环状模板和扩增体系，进行二次孵育，得到所述滚环扩增产物，即双G-四链体；将所述滚环扩增产物与KCl、ThT混合并进行反应，使所述双G-四链体具有荧光性，最后向最终反应产物中加入ddH2O，并进行荧光测量，
6.根据权利要求1-5任一项所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，S1中，所述DNAzyme的制备方法包括使所述酶链、所述底物链与缓冲液的混合物于80℃反应5min，随后冷却至25℃反应40min，即得到所述DNAzyme。
8.根据权利要求6所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，S2中，所述一次孵育的条件包括30℃下孵育1小时；
9.根据权利要求8所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，S3中，所述环状模板、T4 DNA ligase、phi29 DNA polymerase、T4 DNA ligase缓冲液、phi29DNA polymerase缓冲液、dNTP的添加体积比为1∶0.5∶0.5∶2∶2∶2；
10.根据权利要求1-9任一项所述的DNAzyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法在食品领域的铅离子检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，包括采用dnazyme和滚环扩增联用的方法进行特异性铅离子的检测；
2.根据权利要求1所述的dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，所述dnazyme由酶链和底物链组成；所述酶链包含滚环扩增的引物序列。
3.根据权利要求2所述的dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，所述酶链的序列如seq id no：1所示，所述底物链的序列如seq id no：2所示。
4.根据权利要求1所述的dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，所述酶链、所述底物链和所述环状模板的添加的摩尔比为1∶1∶1。
5.权利要求1所述的dnazyme和滚环扩增联用的铅离子检测方法，其特征在于，将待测样本与所述dnazyme进行一次孵育后，加入、环状模板和扩增体系，进行二次孵育，得到所述滚环扩增产物，即双g-四链体；将所述滚环扩增产物与kcl、tht混合并进行反应，使所述双g-四链体具有荧光性，最后向最终反应产物中加入ddh2o，并进行荧光测...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐建国，郭隆华，彭育勃，眭珠琦，杨海东，
申请(专利权)人：嘉兴学院，
类型：发明
国别省市：
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