【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程，更具体地说，涉及生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法及应用。
技术介绍
1、瓦雷兹芽孢杆菌(bacillus velezensis)fzb42是革兰氏阳性植物根际促生菌，它在1998年从德国甜菜根际分离并在2007年作为第一个解淀粉芽孢杆菌进行了全基因组测序。fzb42已经商品化，其以生物膜方式定殖于植物根部并促进植物生长。细菌生物膜的发育是一个复杂的循环过程，包括初始附着、形成、成熟和分散等环节。除了形成生物膜帮助定殖外，fzb42还可以合成吲哚乙酸(iaa)促进植物生长。fzb42作为植物根际促生菌拥有广泛的应用前景，因此分析其促生机理具有深远的意义。
2、fzb42已完成全基因组测序，这为筛选生物膜调控基因提供了前提。鉴于生物膜对fzb42定殖是发挥其促生功能的关键因素，因此筛选fzb42生物膜调控基因有助于发掘其促生价值。
3、芽孢杆菌形成芽孢以在营养物质的培养中存活。多年来，控制芽孢形成的复杂调控网络已被逐步阐明。五种组氨酸激酶，即kina、kinb、kinc、kind和kine，感知并传递环境信号，最终导致spo0a磷酸化，spo0a是产孢基因的中心转录调节因子。
4、kina是磷酸酯酶中调节芽孢形成的主要组氨酸激酶。在饥饿和应激时，kina自身磷酸化，并通过spo0f和spo0b将其磷酸盐转移到spo0a。kina有三个pas结构域，用于感应细胞的氧化还原状态，它的转录受稳定期sigma因子σh的控制。
5、然而关于kina在生物膜
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法，用于构建生物膜分散调控基因kina敲除株；本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供生物膜分散调控基因kina敲除株的应用，用于筛选优良促生菌株。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法，包括以下步骤：
4、1)构建生物膜分散调控基因kina敲除片段；
5、2)将所构建的生物膜分散调控基因kina敲除片段转化到瓦雷兹芽孢杆菌fzb42中；
6、3)培育筛选得到生物膜分散调控基因kina敲除株；
7、所述生物膜分散调控基因kina的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8、所述生物膜分散调控基因kina敲除片段的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9、所述生物膜分散调控基因kina敲除片段的敲除片段的构建方法为：基于生物膜分散突变文库，通过反向pcr鉴定得到生物膜分散调控基因kina，通过重叠pcr获得敲除kina基因的目的片段，即生物膜分散调控基因kina的敲除片段。
10、所述反向pcr引物序列如下：
11、fbo752-f：5’-gcttgtaaattctatcataattg-3’，
12、fbo753-r：5’-agggaatcatttgaaggttgg-3’。
13、任一所述的生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法构建得到的生物膜分散调控基因kina敲除株。
14、生物膜分散调控基因kina敲除株在促进瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用。
15、生物膜分散调控基因kina敲除株在促进色氨酸合成基因trpb、trpc表达中的应用。
16、生物膜分散调控基因kina敲除株在促进吲哚乙酸合成基因ysne表达中的应用。
17、生物膜分散调控基因kina在抑制瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用。
18、生物膜分散调控基因kina在抑制色氨酸合成基因trpb、trpc与吲哚乙酸合成基因ysne表达中的应用。
19、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
20、1)本专利技术基于生物膜分散突变文库，反向pcr鉴定得到生物膜分散调控基因kina，通过重叠pcr获得敲除kina基因的目的片段，将该片段通过化学转化的方法导入野生型fzb42菌株得到kina敲除株△kina。
21、2)本专利技术△kina菌株与野生型fzb42相比，生物膜分散能力缺失。
22、3)本专利技术△kina菌株与野生型fzb42相比，分泌吲哚乙酸(iaa)的水平显著提高。
23、4)本专利技术△kina菌株与野生型fzb42相比，色氨酸合成基因trpb、trpc及吲哚乙酸(iaa)合成基因ysne的相对表达水平均显著上升。
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1.生物膜分散调控基因kinA敲除株的构建方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株的构建方法，其特征在于，所述生物膜分散调控基因kinA敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株的构建方法，其特征在于，所述生物膜分散调控基因kinA敲除片段的构建方法为：基于生物膜分散突变文库，通过反向PCR鉴定得到生物膜分散调控基因kinA，通过重叠PCR获得敲除kinA基因的目的片段，即生物膜分散调控基因kinA的敲除片段。
4.根据权利要求3所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株的构建方法，其特征在于，所述反向PCR引物序列如下：
5.权利要求1-4任一所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株的构建方法构建得到的生物膜分散调控基因kinA敲除株。
6.权利要求5所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株在促进瓦雷兹芽孢杆菌FZB42分泌吲哚乙酸中的应用。
7.权利要求5所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株在促进色氨酸合成基
8.权利要求5所述的生物膜分散调控基因kinA敲除株在促进吲哚乙酸合成基因ysnE表达中的应用。
9.权利要求1所述的生物膜分散调控基因kinA在抑制瓦雷兹芽孢杆菌FZB42分泌吲哚乙酸中的应用。
10.权利要求1所述的生物膜分散调控基因kinA在抑制色氨酸合成基因trpB、trpC与吲哚乙酸合成基因ysnE表达中的应用。
...【技术特征摘要】
1.生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法，其特征在于，所述生物膜分散调控基因kina敲除片段的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.根据权利要求1所述的生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法，其特征在于，所述生物膜分散调控基因kina敲除片段的构建方法为：基于生物膜分散突变文库，通过反向pcr鉴定得到生物膜分散调控基因kina，通过重叠pcr获得敲除kina基因的目的片段，即生物膜分散调控基因kina的敲除片段。
4.根据权利要求3所述的生物膜分散调控基因kina敲除株的构建方法，其特征在于，所述反向pcr引物序列如下：
5.权利要求1-4...
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