【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法及其应用。
技术介绍
1、多能干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞，它具有向三个胚层分化的能力，三个胚层包括外胚层、中胚层和内胚层。其中，由于定型内胚层能够分化为呼吸道和消化道的上皮内层，以及甲状腺、胸腺、肺、肝脏和胰腺等重要的器官，内胚层分化程度的保证对再生医学和药物开发具有重要的临床价值。例如，通过分化发展为胰岛类器官进行移植以治疗糖尿病。然而，定型内胚层分化过程在程度和效率方面仍有显著改进的空间。目前的定型内胚层分化方案主要涉及激活素a和chir-99021。其中激活素a是最关键和主要的内胚层分化的诱导剂，它与tgf-β途径相关，能够促进内胚层基因的表达。但由于激活素a的成本高、消耗量大和与蛋白的不稳定性，因此目前的分化方案在经济上并不可行，加之由于多能干细胞向定型内胚层的分化过程的分子机制尚不明确，因此，进一步优化定型内胚层的分化方案是目前迫切需要解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法及其应用，以至少解决现有技术中难以将多能干细胞分化为高纯度的定型内胚层细胞的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，包括：通过在多能干细胞向定型内胚层细胞分化过程中加入塞卡替尼以促进多能干细胞分化为foxa2和sox17双阳性的定型内胚层细胞；其中，在多能干细胞开始分化前
3、进一步地，塞卡替尼的用量为0.1μm-1μm。
4、进一步地，塞卡替尼的用量为0.5μm。
5、进一步地，塞卡替尼通过抑制fak397位点的磷酸化，以最终提高多能干细胞向定型内胚层细胞的分化比例。
6、进一步地，在多能干细胞向定型内胚层细胞分化过程中加入塞卡替尼具体包括：将多能干细胞在s1培养基中加入s1培养液a进行分化培养1天后再在s1培养基中加入s1培养液b进行分化培养2天以得到定型内胚层细胞；s1培养基为含有0.5μm塞卡替尼的rpmi-1640培养基，s1培养液a包括终浓度为2％bsa、1x its细胞培养添加物、50ng/ml的激活素a和3μm的chir99021，s1培养液b包括终浓度为2％bsa、1x its细胞培养添加物和50ng/ml的激活素a。
7、进一步地，多能干细胞为通过商业途径得到的人胚胎干细胞系h1，人胚胎干细胞系h1开始分化前的预先处理过程包括培养与传代处理，具体包括：从液氮中取出h1细胞，快速置于37℃水浴锅中持续摇动直至融化，将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入5mldmem/f12培养基，混匀后200g离心3min；在生物安全柜中弃去上清，加入2ml预热的pgm1培养基，重悬后将细胞接种于铺有matrigel gfr的6孔板中，转移至37℃、5％co2培养箱培养；每天换液并观察细胞，待细胞汇合度至80％时进行传代；传代时弃去培养基，6孔板每孔用1mldmem/f12培养基漂洗1遍后加入1ml gcdr，置于37℃下消化2min，吸除细胞消化液gcdr，用dmem/f12培养基漂洗1遍后加入1ml预热的pgm1培养基，使用巴氏吸管将克隆刮起，转移至离心管中吹打后将细胞接种于铺有matrigel gfr的6孔板中，每孔补足pgm1培养基至2ml，转移至37℃、5％co2培养箱培养；在开始定向分化前，取对数生长期的h1细胞，6孔板每孔用1mldmem/f12培养基漂洗1遍后加入1mlaccutase在37℃下消化5min，将消化后的单细胞转移至离心管中，加入5ml预热的dmem/f12培养基，混匀后200g离心3min；弃上清后用pgm1培养基重悬细胞，按90％汇合度接种于6孔板中过夜培养。
8、根据本专利技术的另一方面，提供了一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法的应用，应用为根据促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法得到的定型内胚层细胞在用于制备胰腺祖细胞中的应用。
9、进一步地，制备胰腺祖细胞具体包括：将定型内胚层细胞在s2培养基中加入s2培养液进行分化培养3天以得到原肠管细胞；s2培养基为rpmi-1640培养基，s2培养液包括终浓度为2％bsa、1x its细胞培养添加物和50ng/ml kgf；将原肠管细胞在s3培养基中加入s3培养液进行分化培养2天以得到后前肠细胞；s3培养基为rpmi-1640培养基，s3培养液包括终浓度为2％bsa、1x its细胞培养添加物、50ng/ml kgf、0.25μm sant1、2μm视黄酸和200nmldn193189；将后前肠细胞在s4培养基中加入s4培养液进行分化培养5天，每2天更换s4培养液，以得到胰腺祖细胞；s4培养基为dmem/f12培养基；s4培养液包括终浓度为2％bsa、1xits细胞培养添加物、50ng/mlkgf、0.25μm sant1、100nm视黄酸。
10、根据本专利技术的另一方面，提供了一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法的应用，应用为促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法在降低定型内胚层细胞分化过程中激活素a的用量中的应用。
11、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，并应用其制备定型内胚层细胞以制备胰腺祖细胞和应用其降低定型内胚层细胞分化过程中激活素a的用量。
12、本专利技术在naujok o等开发的干细胞分化为定型内胚层细胞的分化方法(naujoko,diekmann u,lenzen s.the generation ofdefinitive endoderm from humanembryonic stem cells is initially independent from activin a but requirescanonical wnt-signaling.stem cell rev rep.2014；10(4):480-93)的基础上提供了一种促进多能干细胞分化定型内胚层细胞的方法，包括：在多能干细胞向定型内胚层分化过程中加入塞卡替尼(saracatinib，sar)—一种发现的可以靶向局灶黏附激酶(focaladhesion kinase，fak)的激酶抑制剂，使得在定型内胚层分化阶段中的局灶粘附相关通路被抑制，从而提高foxa2和sox17双阳性的定型内胚层细胞的分化效率，进而获得纯度更高的定型内胚层细胞。
13、第一方面，本专利技术提供了一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，包括：通过在多能干细胞向定型内胚层细胞分化过程中加入塞卡替尼以促进多能干细胞分化为foxa2和sox17双阳性的定型内胚层细胞。
14、第二方面，本专利技术提供了一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法的应用，应用为根据促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法得到的定型内胚层细胞在用于制备胰腺祖细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，塞卡替尼的用量为0.1μM-1μM。
3.根据权利要求2所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，塞卡替尼的用量为0.5μM。
4.根据权利要求1所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，塞卡替尼通过抑制FAK397位点的磷酸化，以最终提高多能干细胞向定型内胚层细胞的分化比例。
5.根据权利要求1所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，所述在多能干细胞向定型内胚层细胞分化过程中加入塞卡替尼具体包括：
6.根据权利要求5所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，所述多能干细胞为通过商业途径得到的人胚胎干细胞系H1，所述人胚胎干细胞系H1开始分化前的预先处理过程包括培养与传代处理，具体包括：
7.一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法的应用，所述应用为根据权利要求1中所述的方法得到的定型内
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制备胰腺祖细胞具体包括：
9.一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法的应用，所述应用为根据权利要求1中所述的方法在降低定型内胚层细胞分化过程中激活素A的用量中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，塞卡替尼的用量为0.1μm-1μm。
3.根据权利要求2所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，塞卡替尼的用量为0.5μm。
4.根据权利要求1所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，塞卡替尼通过抑制fak397位点的磷酸化，以最终提高多能干细胞向定型内胚层细胞的分化比例。
5.根据权利要求1所述的促进多能干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，其特征在于，所述在多能干细胞向定型内胚层细胞分化过程中加入塞...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁小明，马睿阳，毕焕京，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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