本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种可以抑制动脉粥样硬化的天然属性抗氧化低密度脂蛋白（ｏｘＬＤＬ）ＩｇＭ亚类抗体，其特征是：在无特殊病原体条件下饲养Ｂａｂｌ／ｃ小鼠，高胆固醇饮食４周；分离脾细胞（主要是Ｂ细胞），Ｂ细胞与骨髓瘤细胞以化学方法融合，获得杂交瘤细胞；以氧化低密度脂蛋白（ｏｘＬＤＬ）为抗原，对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）实验，确定阳性克隆孔，利用有限稀释法，筛选出所需克隆阳性细胞。将获得的克隆阳性细胞进行克隆扩增，得到产生单克隆抗体的细胞，获得天然属性的抗ｏｘＬＤＬ免疫球蛋白Ｍ（ＩｇＭ）亚类抗体３Ａ６。该抗体可以用于降低小鼠动脉粥样硬化的形成，为研究动脉粥样硬化的发生发展和治疗提供了新的思路和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种可以抑制动脉粥样硬化的天然辱性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)免疫球蛋白M (IgM)亚类抗体。
技术介绍
动脉粥样硬化是一种慢性血管壁疾病，可以导致心肌梗死，心衰， 外周血管性疾病及中风。多重危险因素在不同方面导致了动脉粥样硬化 的形成，内皮功能受损是动脉粥样病变的起始环节，各种危险因素均可 造成内皮损伤。内皮受损后，血浆低密度脂蛋白(LDL)通过受损的内 皮侵润进入动脉壁，氧化成为oxLDL，被巨噬细胞吞噬，成为泡沫细胞， 逐渐形成动脉粥样硬化斑块，各种原因导致斑块破裂，使局部血小板聚 集，血管栓塞，形成心肌或者脑梗死。在动脉粥样硬化形成过程中，巨噬细胞吞噬oxLDL后形成泡沬细胞 起了关键作用。动脉粥样硬化是一个慢性炎症性疾病，与血管壁的LDL 水平升高明显相关。高脂血症时，血浆LDL浸润进入动脉壁，通过氧化 修饰成为oxLDL。 oxLDL被巨噬细胞上的清道夫受体摄取，这种摄取无 反馈性调节，导致大量胆固醇蓄积，形成泡沫细胞，从而产生强大的致 动脉粥样硬化作用。随着损害的进展，这些充满脂质的细胞许多发生凋 亡，但是不能被充分的清除，导致在损伤部位凋亡细胞不正常的蓄积。 在这种条件下，凋亡细胞有可能发生二次坏死，易变形成为进展的动脉 粥样硬化斑块非蜂窝状的的粥样特性。平滑肌细胞增殖并且分泌厚的胶 原帽可能会稳定这种损害，但是脆弱的斑块区域最终被侵蚀或者破裂， 导致斑块破裂，血栓形成，梗死，缺血等临床事件发生甚至死亡。基于动脉粥样硬化在血管疾病中的不良后果，动脉粥样硬化的预防 及治疗被持续重视，从降低LDL水平角度，目前通过饮食性预防、调脂 药等方法治疗。从斑块破裂，血栓形成的角度，目前有抗栓药治疗。但 是从减少巨噬细胞对oxLDL的摄取，目前还没有成熟的方法，近几年，4关于天然抗体在该领域的研究逐年增多。天然抗体通常定义为人或动物未经明显感染或人工注射抗原而天然 存在于体内的各种抗体。天然抗体的产生与食物、花粉或某些异物的刺激 有关。以IgM亚类为主，可识别多个不同的抗原表位。在维持机体自身正 常内环境的稳定、防止自身免疫病发生等方面具有重要的作用。大量研究 表明天然抗体可以识别多种与动脉粥样硬化相关的脂类或脂蛋白。天然抗 体在动脉粥样硬化形成中的作用，已经达成以下共识天然IgM亚类抗体阻止了巨噬细胞和oxLDL结合，从而封闭了单核-巨噬细胞对oxLDL的摄取，因此，在体内阻止了泡沫细胞的形成，从而降低动脉粥样硬化斑块的形成。在动脉粥样硬化的进程中，oxLDL的抗原决定簇诱导产生天然自身 抗体，由此激活存在oxLDL的高胆固醇血症小鼠的免疫反应，可改善动脉 粥样硬化。oxLDL不仅促炎症和促动脉粥样硬化，并且在氧化过程中产生 的几个新生表位是有很高的致免疫能力，并导致产生天然自身IgM抗体， 抑制动脉粥样硬化进展。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是制备并鉴定小鼠天然属性抗oxLDL IgM亚类抗 体，为研究oxLDL及其天然抗体在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定基础。本专利技术的另一个目的是该天然抗体在预防和治疗动脉粥样硬化领域 中的应用。本专利技术的目的是通过下述方法实现的， 一种抑制动脉粥样硬化的天然 属性抗oxLDL IgM亚类抗体，其特征在于通过杂交瘤细技术制备出天然 属性抗oxLDL IgM亚类抗体3A6,该抗体的作用在于与oxLDL结合形成 免疫复合物，封闭了巨噬细胞对oxLDL的吞噬，减少了小鼠巨噬细胞系 RAW-264.7向泡沬细胞的转化，对apoE(载脂蛋白E)基因敲除小鼠胸主动 脉粥样硬化斑块形成有抑制作用，因此该抗体可以用于抑制小鼠动脉粥样 硬化斑块的形成。该抗体的制备为研究动脉粥样硬化的发生发展和治疗提 供了新的思路和方法。所述抗体的制备步骤如下 (1)抗原的制备LDL的分离提取及oxLDL的制备取空腹12小时5的正常人血浆，通过密度梯度离心法获得LDL 。将制备好的LDL于4°C， PBS透析24h，去除EDTA,与硫酸铜(5pmol/L)在37°C下共同孵育4 h 或者16h。得到铜氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)。(2)杂交瘤细胞的制备在无特殊病原体条件下饲养BaW/c小鼠，给 予高胆固醇饮食4周。分离脾细胞，其主要成分为B细胞。B细胞与骨 髓瘤细胞以化学方法融合，获得杂交瘤细胞。以纯化的LDL和oxLDL为 抗原，对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA实验，确定阳性克隆孔， 利用有限稀释法，筛选出所需克隆阳性细胞。将获得的克隆阳性细胞进行 克隆扩增，得到产生单克隆抗体的细胞，获得所需单克隆抗体。所述小鼠为Babl/c品系小鼠，雌性，4-6周龄。含抗体的腹水制备及抗体纯化(所述单克隆抗体的分离和滴定测定) 腹腔注射0.5ml降植烷(Pristane)或液体石蜡于Balb/c鼠，1 2周后腹 腔注射1乂106个杂交瘤细胞，接种细胞7 10天后可产生腹水，密切观 察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前， 处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，用1/10体积的1.0mol/L氨基丁三 醇(Tris) (pH8.0)调节粗制抗体的pH值。用0.1mol/L Tris(pH8.0)平衡 柱子。将抗体溶液用蛋白G微珠层析柱过滤，每次上2ml的样品。用10 倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。用10倍体积的0.01mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。用2ml的50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱滤柱。收集 洗脱峰于装有1A0体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)的试管内，轻轻摇匀。用 IO倍体积的，lmol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。重复以上过程。测定蛋白浓 度，并进行十二垸基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测抗体 的纯度。所述抗体的单克隆抗体亚类、效价和特异性的鉴定 抗体亚类的鉴定经4次克隆化获得的100%阳性单克隆杂交瘤细胞培养上清作为待检样品，使用Sigma公司小鼠免疫球蛋白亚类夹心ELISA试 剂盒检测杂交瘤产生抗体的亚类和亚型；同上述方法以纯化提取的LDL 包被微量酶标板，常规间接ELISA法测定单抗腹水效价，ABTS (美国 Sigma公司)为显色底物。抗体效价及特异性的鉴定将抗原LDL、氧化4小时oxLDL6(4h-oxLDL)、氧化16小时oxLDL (16h-oxLDL)和两者混合oxLDL (mix-oxLDL ) 5pg/ml分别包被于96孑L ELISA板4。C过夜；以 PBS/0.2n/。Tween洗涤孔4次，然后以含1% BSA的PBS封闭30 min;将腹水 按照l; IO数量级稀释后加入ELISA板中，37。C水浴作用l小时，以 PBS/0.27。Tween洗涤孔4次，加入l: 1000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊 抗小鼠IgM抗体，37。C水浴作用l小时，PBS/0.2。/。Tween洗涤孔4次，加入 ABTS显色10-15min，最后于ELISA读数仪中在410 nm测定吸光度；含 IgM的腹水按照McCarthy等的方法以两步法纯化，即快速的阳离子交换 层析捕获和用阴离子交换色谱洗脱纯化。 所述抗体的作用如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制动脉粥样硬化的天然属性抗氧化低密度脂蛋白抗体，其特征在于通过杂交瘤细胞技术制备出天然属性抗氧化低密度脂蛋白（ｏｘＬＤＬ）免疫球蛋白Ｍ（ＩｇＭ）亚类抗体３Ａ６，该抗体与ｏｘＬＤＬ作用形成免疫复合物，从而减少巨噬细胞对ｏｘＬＤＬ的吞噬。
【技术特征摘要】
CN 2009-7-2 200910303942.61、一种抑制动脉粥样硬化的天然属性抗氧化低密度脂蛋白抗体，其特征在于通过杂交瘤细胞技术制备出天然属性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)免疫球蛋白M(IgM)亚类抗体3A6，该抗体与oxLDL作用形成免疫复合物，从而减少巨噬细胞对oxLDL的吞噬。2、 按照权利要求1所述的抑制动脉粥样硬化的天然属性抗oxLDL 抗体，其特征在于所述抗体的制备步骤如下a抗原的制备正常人血浆，通过密度梯度离心法获得LDL，将制 备好的LDL与硫酸铜共同孵育，得到氧化的LDL (即oxLDL); b抗体的制备[1) 在无特殊病原体条件下饲养Babl/c小鼠，给予高胆固醇饮食4周；[2) 分离脾细胞，其主要成分为B细胞；[3) B细胞与骨髓瘤细胞以化学方法融合，获得杂交瘤细胞；[4) 以纯化的低密度脂蛋白(LDL)和oxLDL为抗原，对阳性杂交瘤 细胞生长孔进行间接酶联免疫吸附测定(ELISA)实验，确定阳性克隆孔， 利用有限稀释法，筛选出所需克隆阳性细胞；[5) 将获得的克隆阳性细胞进行克隆扩增，得到产生单克隆抗体的细 胞，获得所需单克隆抗体。3、 按照权利要求2所述的抑制动脉粥样硬化的天然属性抗oxLDL 抗体，其特征在于使用所述Babl/c小鼠生产抗体。Babl/c品系小鼠为雌性， 4-6周龄。4、 按照权利要求1所述的抑制动脉粥样硬化的天然属性抗o...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯旭阳，徐瑞芬，王海昌，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[]
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