【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种外泌肽、重组载体，细胞及其用途。
技术介绍
1、牡蛎被称为“海底牛奶”，含有丰富的蛋白质、脂肪及磷、铁等等营养成分，且口感鲜美，深受人们喜爱。据统计，2021年，福建省牡蛎养殖面积达3.7万公顷，产量达211.2万吨，位居全国第一。在巨大的牡蛎消费市场的背后，隐藏着的是牡蛎壳所带来的污染问题。据计算，仅福建省2021年即产生了147.84万吨废弃牡蛎壳。牡蛎壳随意堆积不仅占据了大量的土地资源，还造成了极大的环境污染，而其中最主要的原因的牡蛎壳难降解及其降解产物难利用的问题。壳聚糖是牡蛎壳降解产物之一，其进一步降解产生的低聚壳聚糖具有许多独特的生物活性，主要体现为：1)低聚壳聚糖具有广谱的抗菌活性，由壳聚糖抗菌实验结果可知，其对多种球菌、杆菌和真菌均具备抑菌作用。2)低聚壳聚糖良好的生物相容性，并且实验验证其不具有毒性，因此常作为药物缓释材料应用于生物医药领域。3)此外，低聚壳聚糖具有明显的保湿性能，结合其抑菌功能，可以应用于保湿、防晒等护肤品中。因此由高聚壳聚糖降解制备低聚壳聚糖成为当下的研究热点。
2、目前主要利用物理法、化学法和酶法进行壳聚糖的降解。物理法和化学法主要借助机械力或强酸等氧化性极强的化学试剂将壳聚糖的β-1,4糖苷键打断，从而得到壳聚糖低聚物，但这些方法仍然存在许多问题，如反应不易控制、环境污染严重、产物收率低和反应不完全等缺点。酶法降解壳聚糖主要通过生物催化的方法降解高聚壳聚糖，反应温度较低，反应环境接近ph7.0，产物分子量可控，因此相比于其他两种降解方式
3、壳聚糖水解酶是一种由细菌和真菌产生的酶，能够催化壳聚糖生成壳寡糖，主要来源于糖苷水解酶(gh)家族8、46、75和80，其中gh8壳聚糖酶家族与糖基结合机制已经得到广泛研究，如chok酶活性结构区域的带电氨基酸和疏水性氨基酸能够特异性识别glc和glcn残基。但壳聚糖水解酶作为一种胞内酶，纯化工艺繁琐，纯化成本较高，其工业化制备和应用受到限制。
4、需钠弧菌是一种海洋来源的革兰氏阴性菌，其生长速率是大肠杆菌的一倍，是目前生长最快的非致病菌，因此得到广泛的关注和研究。需钠弧菌底盘细胞的开发和应用已经取得初步的成果，但是其基因组中功能性元件的开发和应用仍然是大家关注的热点。
5、基于需钠弧菌的基因组信息进行分析，挖掘具备外泌功能的多肽，结合壳聚糖水解酶的外泌生产，并应用于壳聚糖的水解，解决酶法降解壳聚糖的成本昂贵的问题，具有很好的应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种具有较高外泌活性的外泌肽。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种具有外泌功能的外泌肽，其特征在于，所述外泌肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3、本专利技术还提供一种编码所述外泌肽的基因序列，其特征在于，所述基因序列如seqid no:2所示。
4、本专利技术还提供一种重组载体，其特征在于，含有所述外泌肽的基因序列；或含有所述外泌肽的基因序列和壳聚糖水解酶序列。
5、本专利技术还提供一种重组菌株，其特征在于，包含所述的重组载体。
6、本专利技术还提供一种宿主细胞，其特征在于，包含所述的菌株。
7、本专利技术还提供一种外泌肽在全细胞催化降解的应用方法，其特征在于，将含有所述外泌肽的基因序列和壳聚糖水解酶序列的重组载体诱导表达后，于培养基中加入壳聚糖反应，可使壳聚糖降解。
8、进一步，所述壳聚糖的工作浓度为1-4g/l；反应的条件为30-37℃，反应ph为7.0±1；时间为70±10小时。
9、所述外泌肽来源于需钠弧菌atcc14048，是在其他微生物中未发现的具备外泌功能的多肽序列。
10、本专利技术所述外泌肽具有较高的外泌活性，相比较于已报道的外泌肽aly01，其外泌活性高出5倍。
11、本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如质粒，噬菌体及反转录病毒等。
12、本专利技术的重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括：氯化钙热激法，点转化法，peg介导法，基因枪法等。
13、本专利技术在验证外泌肽功能时，使用抗gfp抗体检测携带pet-28a(+)_zyl-his-gfp质粒的大肠杆菌菌液过滤上清液中分泌的his-gfp，通过蛋白质印迹法验证了本专利技术提供的外泌肽具备外泌功能。
14、综上所述，本专利技术主要具备以下有效效益：
15、1、本专利技术通过signalp5.0筛选预测出需钠弧菌中潜在的具备外泌功能的多肽序列，并将其重组表达于大肠杆菌中，获得能够表达该外泌多肽序列的重组大肠杆菌工程菌株e.coil pet-28a(+)-zyl，为外泌肽的挖掘和应用拓宽了资源。
16、2、本专利技术所挖掘的外泌肽序列，其连接绿色荧光蛋白进行外泌功能表征时，相比于已报道的外泌肽aly01，其外泌效率提高了4.8倍。
17、3、本专利技术提供的外泌肽连接壳聚糖水解酶重组菌e.coil pet-28a(+)-zyl-chok，该菌株具备全细胞催化降解壳聚糖的功能，最适催化条件为，壳聚糖添加量2g/l，反应温度37℃，反应ph为7.0，外泌壳聚糖水解酶催化活性达到0.257u/ml。
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1.一种具有外泌功能的外泌肽，其特征在于，所述外泌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种编码权利要求1所述外泌肽的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ IDNO:2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述外泌肽的基因序列；或含有权利要求2所述外泌肽的基因序列和壳聚糖水解酶序列。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组菌株。
6.一种外泌肽在全细胞催化降解的应用方法，其特征在于，将含有权利要求2所述外泌肽的基因序列和壳聚糖水解酶序列的重组载体诱导表达后，于培养基中加入壳聚糖反应，可使壳聚糖降解。
7.如权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述壳聚糖的工作浓度为1-4g/L；反应的条件为30-37℃，反应pH为7.0±1；时间为70±10小时。
【技术特征摘要】
1.一种具有外泌功能的外泌肽，其特征在于，所述外泌肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.一种编码权利要求1所述外泌肽的基因序列，其特征在于，所述基因序列如seq idno:2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述外泌肽的基因序列；或含有权利要求2所述外泌肽的基因序列和壳聚糖水解酶序列。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。
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