本发明专利技术涉及用于改善遗传感受态的微生物、基因、材料和方法。特别地，本发明专利技术提供了用于改善厚壁菌门缀合感受态的单个基因/蛋白质及其组合，并且还提供了涉及这样的基因、蛋白质和相应组合的方法和用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、厚壁菌门微生物是工业发酵过程中的重要微生物。因此，普遍需要操作这样的微生物中的核酸，例如使它们能够产生目的物质或防止或减少发酵过程中不想要的物质的产生。然而，众所周知，引入以下核酸是很困难的。迄今为止，已应用了三种主要的核酸转移机制：试图将裸dna直接引入微生物的转化技术，例如通过电穿孔；(2)通过噬菌体的转导；(3)通过细菌的缀合。像电穿孔这样的直接转化技术在厚壁菌门中并不总是产生高效率，例如类芽孢杆菌属等几个属甚至通常被认为是不能通过普通技术转化的。通过噬菌体的转导相对繁琐，并且由于噬菌体胶囊体积有限以及需要添加噬菌体转移机器转移所需的核酸元件，因此核酸转移的大小受限。因此，缀合被视为一些微生物的首选转移方法，这些微生物没有通过彻底诱变而单独成为转化感受态。在缀合中，在第一微生物(“供体微生物”)中提供靶核酸，用于转移至第二微生物(“靶微生物”)中，其中该供体微生物比该靶微生物更易于遗传操作。供体微生物和靶微生物混合后，在供体微生物和靶微生物之间形成等离子体桥，该等离子体桥允许线性dna、质粒dna和/或染色体细菌dna的转移。尽管缀合技术克服了转化技术的许多有时难以克服的障碍，但转移效率通常较低。因此，缀合不允许不同靶微生物集合的高效转化。然而，例如在高通量环境中，例如对于前瞻性生产宿主库的操作和后续分析，这将是必需的。特别地，已知类芽孢杆菌属微生物的缀合效率低。
2、因此，本专利技术的目的是提供用于改善厚壁菌门微生物，优选地类芽孢杆菌属的可转化性的材料和方法，特别是基因、核酸和蛋白质。
技术实现思路
1、本专利技术提供了微生物，其包含
2、a)突变体degs基因和任选地突变体degu基因，或
3、b)突变体spo0a基因，
4、其中该微生物相对于相应野生型菌株表现出增加的缀合感受态。
5、本专利技术还提供了增加微生物缀合感受态的方法，该方法包括在该微生物中提供以下的步骤：
6、a)突变体degs基因，其中
7、-该degs基因编码缺乏功能性单结合结构域、功能性磷酸受体结构域和/或功能性atp酶结构域的degs蛋白，和/或
8、-该degs基因编码degs蛋白，其中该突变包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其组成，
9、以及任选地突变体degu基因，其中
10、-该degu基因编码具有降低的dna结合活性和/或缺乏功能性dna结合结构域的degu蛋白，和/或
11、-该degu基因编码degu蛋白，其中突变按对每个替代方案aa)和ab)的优选性的递减顺序包含以下中的一种或多种或由其组成：
12、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r
13、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a
14、或者
15、b)突变体spo0a基因，其中
16、ba)该突变位于dna结合结构域或接收结构域，并导致spo0a蛋白磷酸化的减少或消除和/或二聚化的减少或消除，和/或
17、bb)该突变由以下中的任一种组成或包含以下中的任一种：
18、-a257v、更优选地a257s，
19、-i161r、更优选地i161l，
20、-按优选性的递减顺序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r。
21、本专利技术还提供了在两种微生物之间转移遗传物质的方法，该方法包括
22、1)在第一微生物中提供：
23、a)突变体degs蛋白，其中
24、-该degs蛋白缺乏功能性单结合结构域、功能性磷酸受体结构域和/或功能性atp酶结构域，和/或
25、-该突变包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其组成，
26、以及任选地突变体degu蛋白
27、-该蛋白具有降低的dna结合活性和/或缺乏功能性dna结合结构域，和/或
28、-其中该突变按对每个替代方案aa)和ab)的优选性的递减顺序包含以下中的一种或多种或由其组成：
29、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r
30、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；
31、或者
32、b)突变体spo0a蛋白，其中
33、ba)该突变位于dna结合结构域或接收结构域，并导致spo0a蛋白磷酸化的减少或消除和/或二聚化的减少或消除，和/或
34、bb)该突变由以下中的任一种组成或包含以下中的任一种：
35、-a257v、更优选地a257s，
36、-i161r、更优选地i161l，
37、-按优选性的递减顺序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r，
38、以及
39、2)将该第一微生物与缀合感受态第二微生物缀合，
40、其中，在步骤2之前，该第一微生物包含待转移的遗传物质。
41、此外，本专利技术提供了表达载体，其包含用于表达反向选择性标记和以下的表达盒：
42、a)突变体degs基因，其中
43、-该degs基因编码缺乏功能性单结合结构域、功能性磷酸受体结构域和/或功能性atp酶结构域的degs蛋白，和/或
44、-该degs基因编码degs蛋白，其中该突变包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其组成，
45、以及任选地突变体degu基因，其中
46、-该degu基因编码具有降低的dna结合活性和/或缺乏功能性dna结合结构域的degu蛋白，和/或
47、-本文档来自技高网
...
【技术保护点】
1.一种微生物，其包含
2.根据权利要求1所述的微生物，其包含突变体degS基因，其中
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其包含突变体degU基因，其中
4.根据权利要求1所述的微生物，其包含突变体spo0A基因，其中
5.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其中
6.根据权利要求5所述的微生物，其中该微生物包含
7.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其中该突变体degU和degS或spo0A基因分别提供在位于染色体外核酸上的相应表达盒中，并且其中该染色体外核酸进一步包含反向选择性标记。
8.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其中该微生物选自以下分类等级：
9.一种增加微生物缀合感受态的方法，该方法包括在该微生物中提供以下的步骤：
10.一种在两种微生物之间转移遗传物质的方法，该方法包括
11.根据权利要求10所述的转移方法，其中该第一微生物是根据权利要求7所述的微生物，并且该转移方法进一步包括针对该反向选择性标记进行反向选择的步骤。
12.一种表达载体，其包含用于表达反向选择性标记和以下的表达盒：
13.以下：
...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种微生物，其包含
2.根据权利要求1所述的微生物，其包含突变体degs基因，其中
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其包含突变体degu基因，其中
4.根据权利要求1所述的微生物，其包含突变体spo0a基因，其中
5.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其中
6.根据权利要求5所述的微生物，其中该微生物包含
7.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其中该突变体degu和degs或spo0a基因分别提供在位于染色体外核酸上的相应表达盒中，并且其中该染色体外...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·梅，A·赫罗尔德，D·C·海因里希，H·森德罗斯基，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：
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